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1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物
浓度之间也具有类似的关系。A∝c
朗伯定律：A=K2*L

比尔定律：A=K3*C

透过光的强度It；与入射光的强 度Io比之比称为透光度或透光率， 用T表示。 T＝ It / Io
朗伯-比尔定律的表达式
A＝lg（I0/It)= kL c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； L：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· L－１；
E h h
c

分子能级跃迁
分子能级跃迁较原子 能级跃迁更为复杂。 分子内部除了电子运 动状态外，还有核间 的相对运动，即核的 振动和分子围绕着重 心的转动。
E Ev Er Ee
振动能变化、转动能变化以及电子运动能量变化
有色溶液的颜色为什么会有深浅？
1、同一种物质对不同波长的光吸收能力是 否存在差异？ 2、不同的物质对相同波长的光的吸收是否 存在差异？ 分子只会选择吸收满足能级差能量的波长 各种分子内部结构不同，分子的能级也千 差万别，各种能级之间的间隔也互不相同， 这样就决定了它们对不同波长的光线的选 择性吸收。
λmax处吸光度A 的差异最大。
（5）吸光度具有加和性，A = A1 + A2 + A3 + ……。
三、比色法
通过显色反应，比较待测溶液与标准溶液 颜色的深浅来确定待测物质的含量为比色 法。 目视比色法 光电比色法 分子吸收分光光度法（分光光度分析法）

分光光度分析法是以物质对光的选 择性吸收为基础的分析方法。
光栅 和棱 镜分 光原 理
3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
k：摩尔吸光系数，单位L· mol－１· cm－１；
或: A＝lg（I0/It)= a L c c：溶液的浓度，单位g· L－１ a：吸光系数，单位L· g－１· cm－１ a与k的关系为： a =k/M （M为摩尔质量）
第二节 紫外可见分 光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
general process
光源 单色器 样品室 检测器 显示
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在320～2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连 续光谱。
吸光光度法的基本原理
颜色的产生白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光
能复合成白光的两种颜色的光叫互
补色光。物质所显示的颜色是吸
收光的互补色。
一、光的基本性质
光的波长λ(cm)、频率 γ (Hz) ，它们与光速c的 关系是：
c
在真空介质中，光速为2.9979×1010cm/s。单个 光子能吸收或发射能量时，能量E与上述三要素的关 系是：

吸收曲线

反映了它在不同的光谱区域内 吸收能力的分布，可以从波形， 波峰的强度、位置及数目来了 解物质内部信息
改变通过某一吸收物 质的入射光的波长， 并记录某物质在每一 波 长 处 的 吸 光 度 （A），然后以波长 为横坐标，以吸光度 为纵坐标作图，这样 的谱图称为该物质的 吸收光谱或吸收曲线。
二、分光光度计的类型
1.单光束
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度， 一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高 的稳定性。
2.双光束
自动记录，快速全波段 扫描。可消除光源不稳定、 检测器灵敏度变化等因素的 影响，特别适合于结构分析。 仪器复杂，价格较高。
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快束交替通过同一
2.单色器（波长选择器）
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光
后所得单色光聚焦至
出射狭缝； ⑤出射狭缝。
根据物 质所吸 收光的 波长范 围不同
可见分光光度法
紫外分光光度法
几乎所有的无 机离子和许多有机 化合物可以用分光 光度法进行测定。 如微生物培养基中 的氮、磷以及各种 微量元素的测定。
通常，待测物质的 含量1～10－5％时， 能够用分光光度法 准确测定。所以它 主要用于测定微量 组分。
分光光度分析法：
光源 单色器 样品 检测器
基于发射的电磁辐射与待测物质相互作 用后所产生的辐射信号与物质组成及结构 关系所建立起来的分析方法。
基本特点：
1、一般光分析法均包含三个基本过程； （1）能源提供能量； （2）能量与被测物之间的相互作用； （3）产生信号。 2、选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色 谱分析）； 3、涉及大量光学元器件。
吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=
1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
A 原理
双光束光度计动画示意
动画
双波长光度计光路示意图
四、光的吸收定律
1.朗伯—比耳定律
• 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和
1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。
E h h
c

E－－光子的能量；h－－普朗克常数（6.625×10－34J· s）
二、能级与跃迁

分子中的电子总是处在某 一运动状态中，每一种状 态都具有一定的能量，属 于一定能级。当它得到时， 电子由于受到光、热、电 等的激发，得到适当的能 量，从一个能级转移到另 一个能级，称为跃迁。
叶绿素的结构和吸收光谱
吸收曲线的讨论
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不 同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 λmax （2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线 形状相似λmax不变。
（3）而对于不同物质，它们的吸收曲线形状 不同。
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在