Megazyme总淀粉测定试剂盒（K-TSTA 04/2009）简介:酸水解法和酶法被广泛的应用于淀粉含量测定,酸水解法仅仅适用于纯净的淀粉样品,应用范围有限。

酶法的前处理步骤上有各种变化，经过凝胶、液化和糊精化作用,糊精水解生成葡萄糖,最终以测量的葡萄糖计算淀粉含量。

AACC方法76-11特殊之处在于：在高压蒸汽和碱性环境下淀粉糊化成为凝胶，然后再用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖进行测量。

AACC方法76-11会低估某些样品的淀粉含量，包括高多糖玉米淀粉和众多的经过加工的谷物产品。

今天应用的众多的测定方法都使用了联合处理方法,如在样品处理过程中或直接在淀粉凝胶化后使用耐热α-淀粉酶。

对于难凝胶的样品(如高多糖玉米淀粉)使用了氢氧化钠或二甲基亚砜作为溶剂。

为确保膳食纤维中的淀粉能够全部溶解，Englyst和Cummings(1988)总结的处理方法中使用了去分支酶,支链淀粉酶。

为了测量极端样品得到满意结果，兼顾数量和可靠性，Megazyme提供了一个总淀粉分析试剂盒，基于使用耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。

这一方法已被AOAC和AACC采用(Method 76.13)。

最近，耐热淀粉酶可在低pH环境下使用。

因此，我们更新了我们的总淀粉测量方法加入了这种酶。

这一改进的最大益处在于可以在同一pH（pH5.0）条件下进行耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶孵育，简化步骤以及减少麦芽酮糖（抗耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解）的产生。

另一改进是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/ NADP+在D-葡萄糖处理步骤(K-TSHK5)。

Megazyme总淀粉分析方法可以测量广泛范围内食品，饲料，植物和谷类产品（自然的或加工的）。

对于大多数样品（例如小麦面粉），淀粉可以在100°C抗耐热性淀粉酶处理步骤中完全可溶。

包含高水平抗性淀粉（例如高多糖含量玉米淀粉）样品，需要先用冷2 M KOH 或热DMSO进行预溶解。

含可溶性淀粉和糊精的样品，无需进行抗耐热性淀粉酶处理。

原理:抗耐热性淀粉酶水解淀粉为可溶性分支麦芽糊精和去分支麦芽糊精。

样品中的抗性淀粉可用2M KOH进行预溶解，再用醋酸钠缓冲液进行中和再进行淀粉酶水解。

或者用DMSO在100°C进行溶解。

淀粉葡萄糖苷酶水解麦芽糊精至D-葡萄糖。

D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸脂，释放出(H2O2)，再用过氧化氢酶催化进行显色反应，产生醌亚胺染料。

样品包含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精可以在分析前用80%乙醇进行洗涤。

单个样品可在70分钟内完成测定。

20个样品可在2小时内完成。

特异性，灵敏度，线性范围和精确性此试剂盒专用于分析 -葡聚糖（包括淀粉，糖原，植物糖原和非抗性麦芽糊精）。

最小可区分的吸收值是0.01吸收值范围。

这对应于1.0mg的D-葡萄糖（或0.9mg淀粉）/L在最大样品体积1ml。

检测极限：2.0mgD-葡萄糖（或1.8mg淀粉）/L，这对应于0.02吸光度区别在最大体积1ml中。

此试剂盒在5-100ugD-葡萄糖范围内呈线性。

一个样品溶液的重复测定中，吸收值会有0.005至0.010的波动。

当样品体积为1ml时，这相当于0.05-1ml/L浓度的D-葡萄糖。

如果样品在准备过程中被稀释，结果需要乘以稀释倍数。

例如在样品准备时，样品称重，如10g/L，变异范围将在0.02至0.05g/100g。

干扰:如果D-葡萄糖的转化在5分钟内完成，不会产生干扰。

可以通过加入D-葡萄糖至反应完成后试管内（例如50ug在0.1ml）以检测干扰。

可以看到吸光度显著上升。

样品内的干扰物质可以通过加入内标进行分析。

可以对这标准进行定量校正。

样品操作中的损失可以通过在起始步骤中加入D-葡萄糖进行校正。

试剂盒成分Megazyme总淀粉含量测定试剂盒提供有足够运行100次试验的试剂,并提供有全部的试验方法:瓶1: 耐热α-淀粉酶(10mL, 3,000U/mL在CERALPHA试剂中pH6.5; 40°C或1600U/mL在CERALPHA试剂中pH5.0; 40°C)。

稳定性>4年, 4°C保存。

瓶2: 淀粉葡糖苷酶(10mL, 3300U/mL在可溶性淀粉)（或200U/mL在p-nitrophenylβ-maltoside*，pH4.5，40°C）稳定性>4年, 4°C保存。

完整的分析程序可在获得。

瓶3: GOPOD试剂缓冲液。

磷酸钾缓冲液（0.26M，pH7.4），对羟基苯甲酸（0.22M），叠氮化钠（0.4%W/V）稳定性>4年, 4°C保存。

注意：1. 如果GOPOD缓冲液存储在-20°C，会形成盐结晶，用双蒸水稀释至1L前必须完成溶解。

2.此溶液含叠氮化钠（0.4%W/V），有毒。

瓶4: GOPOD试剂酶。

葡萄糖氧化酶(> 12,000 U) 和过氧化物酶(> 650 U)和4-氨基安替比林（80mg）。

冻干粉，稳定性>4年, -20°C保存。

瓶5: 葡萄糖标准溶液（5ml，1mg/mL）在0.2% W/V苯甲酸溶液中。

稳定性>4年，室温保存。

瓶6: 标准的玉米淀粉。

淀粉含量见标签。

稳定性>4年, -20°C保存。

准备试剂溶液溶液1 用试剂1（100mM醋酸钠缓冲液, pH5.0，自备）稀释1.0mL瓶1成分至30mL 。

分成小份后冻存。

稳定性>3年, -20°C保存。

注意：如果按照AOAC方法996.11（example b），用试剂4（50mM MOPS缓冲液,pH7.0）稀释酶。

溶液2 此酶不用稀释可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必须使用正确的移液器。

4°C下保存,稳定性>3年。

溶液3 用蒸馏水稀释瓶3成分（GOPOD试剂缓冲液）到1L, 立即使用。

溶液 4 用20ml溶液3溶解瓶4成分再倒回溶液3瓶子。

铝箔纸包裹避光。

这就是葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂) 稳定性: 4°C下保存，3个月；-20°C下保存，12个月；分装成小份再进行冻存，只能冻融一次。

新鲜配制的试剂呈浅黄色或浅紫色。

4°C下保存2-3个月过程中，逐渐变成深紫色。

用水为空白对照时，此溶液的吸光度<0.05。

溶液5&6 同瓶5&6自备试剂1.醋酸钠缓冲液(100mM, pH5.0) +氯化钙(5mM)5.8ml冰醋酸(1.05g/mL)加入900mL蒸馏水,用1M(4g/100mL)NaOH调节pH到5.0,大约需要30mL。

4°C下保存2个月.添加0.74g二水氯化钙完全溶解, 定容到1L, 4°C下保存>6个月。

注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。

室温2年。

必须在pH调完后再加入叠氮化钠。

酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。

2.醋酸钠缓冲液(1.2M, pH3.8)69.6ml冰醋酸(1.05g/mL)加入800mL蒸馏水, 用4M NaOH调节pH到3.8, 定容到1L。

室温下保存12个月。

3.氢氧化钾溶液（2M）加入112.2 g KOH 至900 mL 去离子水，搅拌溶解，定容一升。

储存于密闭容器。

室温下>2年。

4. MOPS缓冲液(50mM,pH7.0)+氯化钙(5mM) +叠氮化钠(0.02%)（仅用于example b分析样品）11.55g MOPS(钠盐, Sigma cat. M-9381)加入900mL蒸馏水, 用1M(10%V/V)HCl调节pH 到7.0,大约需要17mL。

添加二水氯化钙(0.74g)和叠氮化钠(0.2g), 完全溶解, 然后调整到1L, 4°C下保存6个月。

5. 醋酸钠缓冲液(200mM,pH4.5)+叠氮化钠(0.02%)（仅用于example b分析样品）冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入900mL蒸馏水, 用1M(4g/100mL)NaOH调节pH到4.5,大约需要60mL。

加入叠氮化钠(0.2g),完全溶解,然后调整到1L, 4°C下保存6个月。

注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。

室温2年。

必须在pH调完后再加入叠氮化钠。

酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。

设备:1.玻璃试管(圆底;16x120mm或18x150mm)2.离心机(3,000rpm)3.微量移液器(100uL).4.连续分配器5.分析天平.6.分光光度计510nm.7.漩涡混合器8.定时钟9.沸水浴锅和试管夹注意事项:1.GOPOD试剂的孵育时间没有严格规定,但是至少要20分钟,并在60分钟内测定吸光度.2.每次试验必须设定试剂空白对照和葡萄糖对照(100μg, 四倍)。

a)试剂空白对照: 0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液b)葡萄糖对照包括:0.1mL葡萄糖标准溶液(100μg/0.1mL)+3.0mLGOPOD溶液。

因子F （页码13和14）通过D-葡萄糖在标准分析中读得的吸光度进行计算（例如100/1.038=96.386）。

3.每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品4.每一新批此的GOPOD溶液,必须验证其与100μg葡萄糖标准反应产生颜色所需要的最长时间, 通常为15分钟左右。

样品空白:样品空白按照标准试验程序（example A）进行,将第4步修正为添加3mL蒸馏水,第5步中也用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用样品前处理中所用的酒精作为样品空白( example E)。

样品准备示例A.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议的程序，pH5.0孵育）。

1.研磨谷物, 过0.5mm筛（35目）。

2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。

3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v)湿润样品帮助分散, 用漩涡混合器混合。

4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(100mM醋酸钠稀释), 在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟，6分钟的时强烈振荡试管).注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状）。

同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。

如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至12分钟，在4, 8和12强烈震荡。

5.将试管放置于50°C的水浴锅中, 加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,330U在淀粉上）。

充分混合,在50°C下孵育30分钟。

6.将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积, 充分混匀。