另外， 实验对柱温和流速也进行了考察， 在相 同条件下分别设置不同的温度与流速， 结果表明 ３５ ℃， １畅０ ｍＬ ／ｍｉｎ 时分离度最好。
实验分别对不同的提取方法， 不同检测波长， 不同的流动相系统和温度进行了考察， 确定采用甲 醇超声提取枳实中的橙皮苷制备供试品溶液， 以乙 腈－水为流动相进行梯度洗脱， 柱温为 ３５ ℃， 在 ２８４ ｎｍ 波长处检测，能获得分离度较好的峰 。
实验分别以甲醇－水和乙腈 －水为流动相系统 进行梯度洗脱， 记录色图谱， 结果显示以甲醇－水 为流动相进行梯度洗脱， 特征峰出现时间较晚， 相 同梯度下时间推至 ４６ ｍｉｎ 开始出峰， 且峰形稍有 拖尾； 为减少色谱柱损耗尽可能不加酸， 将有机相 换作乙腈， 可以看出谱图特征峰出现时间适宜， 且 峰形明显较好， 分离度好， 使基线漂移小， 同时也 保护色谱柱， 因此以乙腈－水作为流动相， 在 ２８４ ｎｍ 处进行检测， 能获得很好的分离效果。
表 ３ １０ 批药材相似度分析结果
样品编号
相似度
样品编号
相似度
１
０畅９９１
６
０畅９９３
２
０畅９８３
７
０畅９９０
３
０畅９９０
８
０畅９８７
４
０畅９７６
９
０畅９８６
５
０畅９８６
１０
０畅９９３
３ 讨 论
枳实中主要含有挥发油、 黄酮类、 生物碱类等 成分［１１－１３］ ， 柚皮苷和橙皮苷作为黄酮类的主要成 分， 基本可以用于作为枳实药材特征峰的指标。 本 实验对枳实中橙皮苷的提取尝试采用甲醇超声法和 乙醇回流提取法， 对橙皮苷的提取有报道采用传统 加热回流方法， 但高温易将黄酮氧苷成分破坏， 造 成提取率低［１４］ ， 且在高效液相色谱图中可以看出 其中杂质峰相对较多。 用甲醇超声提取法在高效液 相色谱图中显示的杂质峰较少， 所需要的主要特征 峰也都能很明显的体现出来， 因此用甲醇超声提取
基金项目： 辽宁省教育厅科研项目， 项目编号： Ｌ２０１０３３２。 作者简介： 卢静华 （１９６９） ， 女， 辽宁锦州人， 副教授， 硕士学位， 硕士研究生导师， 主要研究方向为中药活性成分分析。
４
辽宁医学院学报 ２０１４ 年 ４ 月， ３５ （２）
样品编号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
（此文图 １－２ 见附页 ２－３）
参考文献：
［１］ 国家药典委员会 畅中华 人 民 共 和 国 药 典 （ 一 部） ［ Ｓ］ ．北 京： 中国医药科技出版社， ２０１０： ２２９．
实验结果表明， １０ 批不同产地的枳实药材其 色谱图整体相貌基本相同， 分离分析效能高， 各特 征峰的相对保留时间一致， 根据计算的相似度结 果，其相似度均大于 ０畅９０， 说明各产地枳实药材 所含化学成分的组成基本一致，各批药材间质量具 有一致性。 因此， 高效液相色谱特征图谱可以用于 枳实药材的品种鉴定和质量评价。 从而为有效的控 制药材内在质量标准提供了科学依据。
２畅５畅２ 稳定性试验 取同一份供试品溶液， 按 “２畅１” 项下条件于 ０， ３， ６， ９， １２， ２４ ｈ 进样检 测， 结果显示各主要共有峰的相对保留时间和相对 峰面积的 ＲＳＤ 值均小于 ３畅０％， 表明供试品溶液在 ２４ ｈ 内稳定性良好， 符合指纹图谱的技术要求。 ２畅５畅３ 重复性试验 取同一批次的供试品溶液 ６ 份， 按 “２畅１” 项下条件测定， 结果显示各主要共 有峰的相对保留时间和相对峰面积的 ＲＳＤ 值均小 于 ３畅０％， 表明重复性良好， 符合指纹图谱的技术 要求。 ２畅５畅４ 特征图谱的建立及评价 取 １０ 批次不同产 地的枳实药材分别按 “２畅３” 项下方法制备供试品 溶液 ， 再按 “２畅１” 项下条件进样并记录色谱图。 根据 １０ 批样品特征图谱的特点， 可以确定 ３ 个峰 作为共有特征峰， 并标定了其中的两个峰， 其 １ 号 峰为柚皮苷峰， ２ 号峰为橙皮苷峰， 这两个峰分离 度较好， 保留时间适宜， 因此可以作为参照峰， 色 谱图见图 １ （Ｃ）。将各批枳实药材的特征图谱信号 导入国家药典委员会主持开发的 枟 中药指纹图谱 相似度评价软件 （２００９ 版）枠， １０ 批药材特征图谱 的共有模式见图 ２， 计算出对照图谱和 １０ 批样品 图谱之间的相似度数据， 相似度计算结果见表 ３。 相似度在 ０畅９０ 以上认为符合要求［１０］ 。 结果发现 １０ 批药材的相似度均在 ０畅９０ 以上， 表明本实验方法 可靠有效。
关键词： 枳实； 特征图谱； 高效液相色谱法 中图分类号： Ｒ２８５畅５ 文献标志码： Ａ 文章编号：１６７４－０４２４（２０１４）０２－０００３－０３
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ Ａｕｒａｎｉｔ ｕｍ ｂｙ ＨＰＬＣ
ＬＵ Ｊｉｎｇｈｕａ１ ， ＨＵＡＮＧ Ｓｈｕｈｏｎｇ２ ， ＴＥＮＧ Ｙｕ１
１ 材 料
１畅１ 仪器 Ｌ －２０００ 高效液相色谱仪 （日本日立公 司， 配二极管阵列检测器）；ＫＱ －１００Ａ 型超声清洗 器 （昆山市超声仪器有限公司）； 天油真空泵 （ 上 海科尔达制泵有限公司）； １８１０－Ｂ 型石英自动双重 纯水蒸馏器 （ 江苏宏华仪器厂）： ＴＤ 型电子天平 （ 德国赛多利斯股份公司） 。 １畅２ 试药 橙皮苷对照品 （ 中国药品生物制品检 定所， 批号１１０７２１－２００５１２ ）； 柚皮苷 （ 中国药品 生物制品检定所， 批号 １１０７２２ －２００６１０ ）； 甲醇、 乙腈均为色谱纯； 样品来源见表 １。
ＪＬｉａｏ辽ｎｉｎ宁ｇ 医Ｍｅ学ｄｉｃ院ａｌ 学Ｕｎ报ｉｖｅｒｓｉｔｙ２０１４ Ａｐｒ．３５（２）
３
不同产地枳实药材的高效液相色谱特征图谱研究
卢静华１ ， 黄淑红２ ， 滕宇１
（１畅辽宁医学院； ２畅９３２６３ 部队医院， 辽宁 锦州 １２１００１）
摘要： 目的 研究并建立枳实药材的高效液相色谱特征图谱。 方法 采用色谱柱Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ （４畅６ ｍｍ×２００ ｍｍ， ５ μｍ）， 以乙腈 （Ａ ） －水 （Ｂ） 为流动相系统进行梯度洗脱； 柱温 ３５℃； 检测波长 ２８４ ｎｍ； 流速１畅０ ｍＬ· ｍｉｎ－１ 。 结果 通 过对 １０ 批不同产地的枳实药材的测定， 建立了枳实药材的指纹图谱共有模式，标定了 ２ 个共有峰， 以化学对照品结合高效 液相色谱图鉴定了这 ２ 个峰。 １０ 批枳实药材的相似度均在 ０畅９０ 以上。 结论 该方法简便， 准确， 重现性好， 为有效控制 药材的内在质量标准提供科学依据。
表 ２ 线性梯度洗脱流动相
时间
９５
５
１０
９０
１５
１８
８２
２３
２３
７７
３５
３０
７０
５０
４５
５５
６０
５０
５０
２畅２ 对照品溶液的制备 分别精密称取橙皮苷和 柚皮苷对照品 ４畅００ ｍ，ｇ 再分别加甲醇制成每 １ ｍＬ 含 ０畅４０ ｍｇ 的溶液， 作为对照品溶液。 ２畅３ 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末 １畅０ ｇ， 加甲醇 ５０ ｍＬ， 超声提取 ２０ ｍｉｎ 后， 滤过， 滤 液定容至 ５０ ｍＬ， 作为供试品溶液。 临用前过 ０畅４５ μｍ 滤膜即可［６－９］ 。 ２畅４ 测定方法 精密量取供试品溶液和对照品溶 液 １０ μＬ， 注入高效液相色谱仪， 记录 ６０ ｍｉｎ 色谱 图， 见图 １。 ２畅５ 方法学考察 ２畅５畅１ 精密度试验 取同 一 份 供 试 品 溶 液， 按 “２畅１” 项下条件重复进样 ６ 次，记录各共有色谱 峰的保留时间和峰面积， 结果显示各主要共有峰的 相对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 的 ＲＳＤ 值 均 小 于 ３畅０％， 表明精密度良好， 符合指纹图谱的技术要 求。
（１畅Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ２畅９３２６３ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１００１ Ｃｈｉｎａ ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ａ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ （４畅６ ｍｍ×２００ ｍｍ， ５ μｍ） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ （Ａ） －ｗａｔｅｒ （Ｂ） ｉｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｄｅ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ｓｅｔ ａｔ ２８４ ｎｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｋｅｐｔ ａｔ ３５ ℃．Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ １畅０ ｍＬ· ｍｉｎ －１ ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｍｕｔｕａｌ ｍｏｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ ｗａｓ ｓｅｔ ｕｐ ｗｉｔｈ “Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆＴＣＭ ”， ａｎｄ ｔｗｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｐｅａｋｓ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓａｍｐｌｅ．Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｏｆ １０ ｂａｔｃｈｅｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ ｗｅｒｅ ａｂｏｖｅ ０． ９０．Ｃｎｏ ｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｖｅｓ ｔｏ ｂｅ ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ， ｐｒｅｃｉｓｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ．Ｉｔ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ａｕｒａｎｔｉｕｍ．