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知识回顾
19世纪40年代初，McClintock在研究 玉米花斑糊粉层和植株色素产生的遗 传基础时，发现并提出了控制因子或 转座因子。
McClintock（1902-
1992）于1983年获得
诺贝尔医学生理学奖。
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插入序列（IS) 细菌转座因子的种类 （根据结构组织和转座机制） 转座子(Tn） 转座噬菌体（Mu)
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插入序列 (Insertion sequence, IS)
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靶DNA
转座子
3和4缺失
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RIM技术筛选细菌毒力基因
随机突变株的构建
选择合适的转座子，构建转座子质粒， 转入待研究细菌
特殊表型突变株的筛选
待研究的基因所对应的功能或表型
PCR-测序确定突变基因的序列
突变基因的定位
构建突变基因的互补质粒，将其转入突 变株中，如表型恢复，则可证明目标基 因的功能
生物膜形成相关基因 的鉴定
Southern blot 分 析
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• 转座随机突变技术的优缺点
诱变率高，可以在很短时间内获得大量突变株； 导致插入性单突变，不会出现化学诱变常出现的多重突 变； 插入序列已知，便于对失活基因进行定位； 具有高通量和操作简单的优势； 适用于与某种功能有关的未知基因的筛选。
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Tn10转座子
• Tn10的两侧IR为IS，为复合转座子。
• 带有四环素抗性基因
IR
不含转座 酶基因 Tn10的结构模式图
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含转座 酶基因
Tn3复制型转 座机制
转座酶
共联体
DNA聚合酶 DNA连接酶
通过重组分 成两部分
形成两个正 向重复序列
突变株的构建和DNA 标签的标记是用转座 子技术同时完成的 运用负选择的策略，采用一组标记了独特的DNA标签的突 变株对模型动物进行感染，通过减毒突变株的确定，检 测DNA标签，从而确定发生突变的基因。
STM
减毒突变株
在宿主体内或者不能生长、繁殖，或者不能有效定植， 或者不能侵入组织，或者容易被宿主防御系统清除，从 而被体内环境所选择掉。
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转座子的遗传学效应
• 可引起基因突变——插入或切离；
• 改变染色质的结构（缺失、倒位等）； • 可以插入新基因（ampR、terR等）； • 在靶序列上造成同向重复序列； • 产生新的变异，有利于进化。
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Goi: gene of interest
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利用转座子构建突变株库
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关键技术点：
• 转座子的选择：随机性好；使用两种转座子，降低发生漏选或者重 复筛选的可能性 • 突变基因测定采用随机引物PCR的方式，已达到自动化目的
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复制型转座
DNA转座的方式
非复制型转座
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转座因子的种类 （根据转座机制）
DNA转座子 RNA转座子
DNA DNA 原核生物和真核生物中
DNA RNA DNA 只存在真核生物中 逆转录转座子
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一个基因或其产物可以在致病菌株种查见，而在非致病菌 株中没有（或发生突变或不表达） 在致病菌株中失活该基因会降低其致病力
将该基因转到非致病菌株中表达会提高其致病力 在致病株感染过程中，该基因会被调控表达 针对该基因产物的体液免疫或细胞免疫具有保护作用
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（Non-essential gene)构建一个相对应的突变株，将所有的突
变株汇集在一起，即构成该细菌的突变株库
构建方法
1）同源重组 （以PCR为基础的单交换 single crossover)
2）转座子法
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单交换同源重组构建突变株
Single cross-over double cross-over
微生物八大生物系统
病毒工厂和病毒与宿主相互作用的分子基础
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第二章 新的细菌毒力因子的发现 与鉴定
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1
细菌转座子随机突变技术
2
标签标记的突变技术
3
基于毒力基因表达调控特点的筛选技术
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供体
转座酶结合在Tn的两个末端
转移末端产生切口
受体
受体被交错切割产生切口
另一条链产生切口
Tn与靶位点融合
Tn10非复型转座机制
供体被释放 复合体
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转座噬菌体（mutator phage）: Mu
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Tn3转座子
•不含IS，为简单转座子。 •含有3个基因：编码β-内酰胺酶的氨苄青霉素抗性基因（ampR），转座 酶基因（tnpA）和编一种阻遏物的调节基因（tnpR）。 •两端为IR。
调节基因 转座酶基因
tnpA
tnpR ampR
氨苄青霉素 抗性基因
IR
IR
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优点
缺点
不同细菌可能需要不同的转座子，且需要保证转座子插 入方式的随机性； 有可能产生极效应，需要验证试验； 需要合适的突变株筛选方法，操作简单，负责会限制大 规模筛选。
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细菌突变株库的建立
概念
细菌单基因突变株库: 针对某细菌的每一个非必需基因
指涉及真正毒力因子的表达及其功能发挥的相关因子，其功能 包括调控毒力基因的表达；通过翻译修饰、合成或分泌过程参 与真正毒力因子的活化或者与其活性相关。
是指促进病原菌在宿主体内定植，逃避宿主免疫，促进胞内生
存或者募集宿主因子促进病原菌存活的相关因子。
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• 一类具有转座功能的溶源性噬菌体 • 1963年，Taylor发现，它是大肠杆菌的温和噬菌体， 38000bp的线状DNA 。 • Mu的特点：几乎可以插入宿主染色体任何一个位置上；两
端没有粘性末端，插入某基因中就引起该基因突变
• 两个优点：不是细菌基因组的正常组分，易于识别；可经
诱导产生，易于制备
互补验证
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Example:转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌 生物膜形成相关基因
无卡那霉素抗性的沙 门氏菌菌株的筛选
转座子质粒的构选
生物膜突变株生长曲 线的测定
（结晶紫染色测定）
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缺点：
1、应用STM 技术时，由于一个操纵子可能有多个基因，转座子插入到
该操纵子区域就会引起下游基因转录的极性效应。因此,被插入失活的 基因是否与病原体毒力表型有关还须用其他方法进行验证； 2、STM 技术的应用还依赖于混合菌体在体内的繁殖复制能力。只有突 变体不能在宿主体内存活时，才能对病原体的毒力基因进行鉴定。
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Saenz HL, Dehio C (October 2005). "Signature-tagged mutagenesis: technical advances in a negative selection method for virulence gene identification". Curr. Opin. Microbiol. 8 (5): 612– 9. doi:10.1016/j.mib.2005.08.01 3. PMID 16126452. 生命科学学院 College of Life Science
转座因子 (transposible element, TE)
存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位.可以从原位 上单独复制或断裂下来，插入另一位点并对其后的基因 其调控作用。
转座 （transposition)
转座子可在细菌的染色体、质粒和噬菌体之间发生位置 的改变的现象
转座主要依赖于自身编码的转座酶（transposase)
3、STM 技术必须以疾病的动物模型作为筛选系统，而动物模型无法真
实地体现出病原体与人相互作用的所有特征。所以应用STM 技术筛选 鉴定到的只能是引起人类疾病毒力基因的一部分
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第三节 基于毒力基因表达调控特点的筛 选技术
• 体内诱导基因（in vivo-induced gene): 病原菌在宿主体内