突变体

结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间 物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代 替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以 其作为自身的营养物质。


筛选抗性株，可成为高产株
抗性突变株的筛选
直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。 往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一 步的人工改造才能真正用于工业生产
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
链霉菌
（三）真菌

抗生素
维生素
酶制剂
有机酸等
药用真菌（大型真菌）

1.藻状菌纲：根霉；犁头霉 2.子囊菌纲：酵母 3.担子菌纲：牛肝菌，灵芝 4.半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶
二、生产菌种的选育
工业化菌种的要求

1.遗传性能要相对稳定
2、微生物的酶


目前的酶多数来源于微生物发酵
医用酶制剂的生产
医药工业用酶
酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高 产量。 生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑 制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制 以及发酵条件等方面需给予注意。

3、微生物代谢产物发酵

包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代 谢产物。 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必 需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或 停止生长时期即稳定期所
（四）维生素类

维生素C的原料药2-酮基-古龙酸，维生素A的前体
B-类胡萝卜素，维生素D2的前体麦角甾醇，维生
素B2，B12等
（四）甾体类激素

甾体类激素的生产过程中，一些特异反应需借
助微生物的反应。
（五）治疗酶及酶抑制剂

药用酶
酶抑制剂
四、发酵工程制药特点及发展趋势

第二章 发酵工程制药
第一节 概述

一、发酵工程
微生物工程:自催化
过程 完整的工业体系
(一)发酵的定义
1、传统发酵

最初发酵是用来描述酵母菌 作用于果汁或麦芽汁产生气 泡的现象，或者是指酒的生 产过程。
2、生化和生理学意义的发酵


指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质 产生能量的一种方式，或者更严格地说，发 酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能 反应。 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒 精并放出CO2。
指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基，菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液
待筛选的菌株能 分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌， 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕 该菌生长
三、菌种保藏

在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期 待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，
(1)传统生物技术

发酵食品 有机酸 氨基酸 核酸类物质 酶制剂 医药工业（抗生素…）


饲料工业（单细胞蛋白
环境工程（废物处理） 其它 （冶金工业…）
抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、 有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、 生物农药、生物肥料等
(2)现代生物技术 基因工程菌发酵
1采样
2.分离菌株
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备
礼来公司花了 10年的时间从 40万株微生物 中，发现了三 种有潜力的新 抗生素。
平板分离
挑选单菌落 发酵试验
(注意形态的观察)
（2)自发突变与定向育种

一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发

发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，
酵母菌和霉菌
细菌
放线菌
（一）细菌

主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等
（二）放线菌

产抗生素最多的一类微生物


另外生产B12,酶，甾体转化
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的 代谢，目前发现的生物来源如下：
真菌（青霉素、头孢等）
放线菌（链霉素；四 环素；红霉素等）
二、发酵类型
1、微生物菌体发酵

定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为 目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、 担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾 病用的疫苗等。药用微生物制剂等。

特点：细胞的生长与产物积累成平行关系， 生长速率最大时期也是产物合成速率最高 阶段，生长稳定期产量最高。

N=10-3

高空取气管是远离地面几十米
的管子。

地面附近空气中所含的微生物 和灰尘等均比高空空气中含的
多，每升高10米，空气中杂菌
可降低一个数量级

因此从高空取气要比从低空取 气有利得多。
油水分离器

其内部同时采用直接拦截，
惯性碰撞，布朗扩散及凝聚
等机理，能有效地去除空气 中的水、油雾、尘埃，内部 不锈钢丝网可清洗，使用寿 命长。
3）搅拌通风装臵


4）足够的冷却面积
5）罐内要减少死角

6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露
罐体：

培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过
程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为 2.5×105 Pa

形状，圆柱形，两端椭圆形, 受力均匀，减少 死角，物料容易排除， 高度与直径比1.7-4：1，有力空气利用率
对于一成功的工业发酵过程极为重要。
斜面低温法：短期保存 石蜡油封存法：中期保存 沙土管：产孢子和芽孢的 麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用 甘油悬液法：基因工程菌
冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以
在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株 无需进行冷冻保藏，便于运输 液氮法：最为有效，保藏15年以上， 宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物
发酵车间的空气过滤器
二、培养基和灭菌

（一）培养基
C源：
N源：
无机盐：
前体，促进剂，抑制剂
2.培养基的类型

孢子培养基：一般用固体培养基，N源不能丰富如：
小米或麸皮培养基

种子培养基：速效的C,N源，与发酵培养基过渡 发酵培养基：迟效与速效的C,N源搭配，加前体等
（二）灭菌方法
的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛
选而产生的这些特性，称为遗传标记。

1.自身耐药突变株 2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株 3.营养缺陷及其回复突变株
饱浸含某种指示 剂的固体培养基 的滤纸片变色圈
固体培养基中渗入溶解性 差、可被特定菌利用的营 养成分，造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。
（1）菌种是根本
（2）理论产量存在“生物学变量”
（3）常温常压下反应，安全，条件简单
（4）纯种培养，防污染
（5）可制备复杂高分子化合物 （6）分子水平，定向发酵，组合生物合成等 （7）发酵工业成本低
发酵工程基本流程
菌种选育
自然界选种、诱变育种、 基因工程、细胞工程
分离纯化
菌体：过滤、沉淀；代谢产物： 蒸馏、萃取、离子交换
2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体 3.目标产物产量接近理论转化值 4.目标产物分泌到胞外 5.尽可能减少类似物产量

6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物
（1）自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌 株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负 突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利， 这种突变成为正突变。
DNA Shuffling与常规定向进化的比较
项目 常规定向 进化 DNA Shuffling 进化速度 缓慢进化 快速进化 进化对象 整个基因组 特定基因/ 操纵子/病毒 进化 周期 多年 几天 影响对象 完整基因组 部分基因组 突变效率 低 高
筛选

从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢

1.空罐灭菌：高压水
蒸气，消灭死角

当培养基（或物料） 尚未进罐前对罐进行 预先灭菌
罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计 管和测控仪器接口


（二）发酵辅助设备

无菌空气系统：过滤除
菌（使用活性炭，石棉
滤板，多孔合成树脂等）

灭菌系统 发酵车间的管道阀门等

发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂
质，无水，无油，正压等几项指标；

发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵 过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许 有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为
第三节、发酵设备及消毒灭菌

一、发酵设备
发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一
一个优良的培养装臵应 具有：


严密的结构
良好的液体混合性能
高的传质和传热速率
灵敏的检测和控制仪 表
1、搅拌釜式反应器：目前使用
最广泛的发酵反应器
机械搅拌发酵罐

1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高


2）能耐受一定的压力



搅拌器
档板
克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动
改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧 速率

消泡器 锯齿式、梳状式及孔板式


装于搅拌轴上，齿面略高于液面