实验论文
土壤中产抗生素放线菌的筛选及抗菌谱的测定作者：天奇666666
2017 年06 月
目录
摘要 (3)
1、引言 (4)
2、实验材料与方法 (4)
2.1材料 (4)
2.1.1 土壤样品 (4)
2.1.2 培养基 (4)
2.2 实验方法及步骤 (5)
2.2.1 放线菌的分离及最佳土壤稀释浓度的选择 (5)
2.2.2放线菌纯化培养 (5)
2.2.3 保存备用菌株 (5)
2.2.4 供试菌液配置 (5)
2.2.5进行拮抗试验 (5)
3、实验结果与分析 (6)
3.1实验结果表（表二） (6)
3.2实验照片 (6)
3.3实验结果分析 (7)
4、结论与讨论 (7)
4.1结论 (7)
4.2讨论 (7)
5、参考文献 (8)
摘要
本次实验选取了学校八个采样点进行采样，通过土壤悬液稀释进行固体培养基涂布培养，分离纯化出对其他微生物有拮抗作用的放线菌，使用牛肉膏蛋白胨固体培养基和PDA培养基进行抗菌谱测定。
本次实验以双管齐下的方式分别进行主实验与次实验，保证了实验重复性并极大节省了时间，实验过程分两批进行，主实验通过培养细菌与真菌菌液，涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基平板分离出了五珠无拮抗作用的放线菌，次试验通过点接的PDA培养基的方式分离出一株对枯草芽孢杆菌有抗性而对黑曲霉有轻微抗性的放线菌菌珠。
关键词：土壤、放线菌、拮抗作用
1、引言
土壤----作为生物生存一种基本的资源，其中蕴藏着巨大的微生物资源，特
别是以能产生多样的次级代谢产物而著称的放线菌，研究土壤沉积微生物，不仅
可以发现新的放线菌资源，同时也可能发现新型活性产物，在医药、食品、化工、环保等行业意义巨大。
放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物, 目前从微生物中发现的大约 8 000 种生物活性物质中, 近 70 % 是由放线菌产生的。
放线菌是一群革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% ) 的细菌。
放线菌因菌落呈放线状而的得名。
它是
一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。
与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。
2、实验材料与方法
2.1材料
2.1.1 土壤样品
理工大西校区西门附近校区内随机取8个采样点,采样点的选择以农田土壤、经
常疏松的的种植土壤以及含有机质较为丰富的为主。
2.1.2 培养基
高氏合成一号培养基：溶液与试剂、可溶性淀粉、NaCI、KNO3 、K2 HPO4 3H2 O MgSO4 ．7 H2 O 、FeSO4 ．7 H2 O，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCI。
仪器与其他用具：试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，高压蒸汽灭菌器，PH试纸，棉花，牛皮纸，麻绳，纱布等
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏、蛋白胨、NaCl
PDA培养基：新鲜土豆；琼脂；葡萄糖、电磁炉；锅（带盖）；漏勺；刀、烧杯
纱布；玻璃棒；天平；称量纸；蒸馏水
2.1.3 供试菌种
大肠杆菌、黑曲霉、金黄葡糖球菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、毛霉（菌种来自实验室课程实验老师）
2.2 实验方法及步骤
2.2.1 放线菌的分离及最佳土壤稀释浓度的选择
称取 5g 处理后土壤样品, 制成分别稀释成 10^-3、10^-4、10^-5倍的土壤样品悬浮液, 充分振荡, 静置 20 min 后, 分别将适量上清液吸入高氏合成一号平板上, 并用三角环涂均匀, 置于 28℃恒温组织培养箱内培养 2~ 4 d, 观察和鉴定各类微生物的出现情况, 确定最佳土壤稀释浓度, 并将其中的放线菌挑出。
2.2.2放线菌纯化培养
将已经分离的放线菌纯化在高氏一号固体培养基上、放在37℃的恒温培养箱中进行2—4天培养，中间定期观察生长状况，防止污染。
2.2.3 保存备用菌株
将已纯化的放线菌挑入高氏一号斜面上进行保存，保留备用。
2.2.4 供试菌液配置
将供试菌种(毛霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌)在超净工作台内用接种环点接至牛肉膏蛋白胨液体培养基试管中，放进28℃摇床中隔夜培养。
2.2.5进行拮抗试验
第一次实验（主实验）将培养皿用记号笔分成五等分，将菌液涂布在培养皿（牛肉膏蛋白胨固体培养基）上，将以分离纯化出的四种放线菌（后又长出一种记为5号）编号，点接在已涂布的培养皿上，留有空白。
在28℃恒温培养箱中培养2—4天，观察抑菌圈测量半径。
第二次试验（次实验）培养皿分成两等份，将5、6（6号为一珠有抑菌圈的菌株）点接在PDA培养基上，同时将真菌（黑曲霉）点在放线菌周围，隔天将细菌点在放线菌周围。
在恒温箱中培养2-4天，观察抑菌半径，并测量。
（表一）土壤稀释倍数与菌落重叠率（微生物学杂志）3、实验结果与分析
3.1实验结果表（表二）
——没有抑制作用；++抑制；+抑制不明显；=没做；\污染3.2实验照片
图一图二图三图四图五
3.3实验结果分析
3.3.1由表二和图四可知，6号放线菌对枯草芽孢杆菌产生拮抗作用，而且抑菌圈比较明显，对于在有放线菌的位置，其枯草芽孢杆菌的芽孢沿着与放线菌位置相反的方向繁殖，且在放线菌中心的位置，内侧形成光滑的弧线状。
对于拮抗作用比较强的放线菌在与枯草芽孢杆菌共培养时产生其单培养时没有的物质【2】。
6号放线菌在与黑曲霉共培养的过程中，黑曲霉的申展方向沿与放线菌相反的方向，其生长状态为以中心为最小部分的扇子状，黑曲霉自始至终没能将放线菌覆盖，并且保持着较为短的生长距离。
3.3.2由表二和图一可知金黄葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉和黑曲霉的拮抗试验中1、3、4号放线菌产生了污染。
3.3.3表二可知5号放线菌对所有供式菌种没有拮抗作用，2号对金黄葡萄球菌、大肠杆菌、毛霉、黑曲霉没有抑制作用。
图五可知没有拮抗的放线菌和金黄色葡萄球菌挤在一起，故没有抑制作用。
4、结论与讨论
4.1结论
山东理工大学西校区土壤内含有大量放线菌，但具有拮抗作用的菌株可能比较少，本次实验所培养数量并不多，却发现了6株放线菌，但仅有一株对细菌有拮抗作用，放线菌作为一种能产生抗生素的重要菌种，在研究其新种类，开发新型抗生素具有重大意义。
而要找出具有拮抗作用的放线菌，可能需要跟多的供式菌种，也许在本次筛选出的那些没有抑制作用的放线菌，会对其他的菌种产生作用，所以每一种放线菌对不同的供式菌都会有其相应的作用，只是需要人类时间的验证，而将每一种放线菌对应到一种或几种供试菌并产生作用是人类研发放线菌的一个重大课题。
4.2讨论
实验过程中发现了各种放线菌生长速度不一，有些只需一天即可长成可见菌株，而有些则需要更多时间，所以对时间不久的平板不能很快扔掉而需要及时保存。
并发现了细菌生长速度远大于放线菌，体现于对细菌没有抗性的放线菌若同
时和细菌处于一起时，在细菌生长完成后，放线会从细菌中心长出；如果对细菌有拮抗作用的放线菌，在细菌完成生长之后迅速占据细菌空间。
5参考文献
1 王静，杨澄然，郭芳芳，姜伟等，一株放线菌的分子鉴定与抗菌谱研究【J】安徽农业科技2011.39（34）
2 黄兵，刘宁，放线菌与枯草芽孢杆菌的共培养及其对活性次生代谢产物的影响【J】生物工程学报2012.4.09。