2、作用机理
• 麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)是一类阻 断神经细胞钠离子通道，对人体神经系统产生麻痹作用的 海洋生物毒素。该毒素对人体毒性极强，且无特效解救药 物，对人类健康影响很大。我国近海多种可食用贝类中均 含有麻痹性贝毒，福建省东山县广东省大亚湾及台湾省近 年都发生因食用染毒贝类而引起多人中毒死亡事件!
c、细胞毒性检测法
根据离子通道类毒素可以专一性地作用于细胞膜离子通 道的特点建立起来的细胞毒性检测技术，可以快速敏感的检 测毒素。它是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素存在与 否以及毒性大小的一种技术，可以直接体现所测样品的毒性 状况。 麻痹性贝毒（PSP)可以作用于Na+通道的1位点，阻断 Na+内流，当在培养的细胞中加入Na+通道活化剂，细胞会由 于Na+内流过多而造成肿胀，甚至死亡，但如果同时加入具 Na+通道阻断作用的毒素PSP, Na+内流会因拮抗作用而受到 限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在，并根据细 胞的成活率对毒素进行定量分析。
讨论
上述提取的1,2,3,4号提取液经薄层层析后在层析板上均 可见四个黄褐色斑点，这与文献报道的河豚鱼体内含有河豚 毒素、河豚酸、卵巢毒素和肝脏毒素相吻合，且各自的Rf值 相近，其中一个斑点特别明显，推测可能为河豚毒素。从扫 描结果分析对比平行斑点的直径之间存在显著差异:1号提取 展开的四个斑点直径均比2,3,4号的斑点直径大，尤其是河豚 毒素的斑点直径更为明显。也就是说，1号乙酸提取的河豚 毒素含量高于其他三种，这与小白鼠中毒实验得出的结论一 致。
瑞士卡玛TLC scamner-3 全自动薄层层析仪
薄层层析结果与讨论
• 结果: • 肉眼观察1,2,3,4号提取液经薄层层析后在层析板上分别呈 现四个黄褐色斑点，这些斑点直径不等，但展距(Rr值)相 近，差别可能是溶剂的极性不同引起的。经复日成像系统 扫描后这四个斑点清晰可见:1号所得的主斑点的直径相对 较大。
讨论
• 本实验中采用的两组小鼠实验因为注射的样品量不同，直 接导致了小鼠的不同行为症状，注射0.8 ml样品液的小鼠 大量出汗、打颤、但没有死亡，2天后恢复正常。通过对 注射lmL样品液的小白鼠中毒实验死亡症状的观察，验证 了甲醇、乙醇、乙酸、水这四种溶剂均能提取出河豚毒素， 但死亡时间不一致可证明其提取的毒量的差异，因均取材 于同一河豚鱼故可抵消毒素的不同和毒力强弱这些因素带 来的影响，所以小白鼠从注射到死亡的时间越长，说明其 含毒量越低。即2,3,4号的含毒量较1号乙酸提取的河豚毒 素含量低。从此实验可初步得出河豚毒素经乙酸提取的效 果要好于甲醇、乙醇、水三种溶剂。
b、高效液相色谱法(HPLC)分析
高效液相色谱法(HPLC)又称"高压液相色谱"、"高速液 相色谱"、"高分离度液相色谱"、"近代柱色谱"等。高效液 相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高 压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合 溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各 成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分 析。
④TTX的鉴定与检测
• a、小白鼠生物检测法 • 选择体重为25士2g左右的小白鼠，随机分为两组，分别腹 腔注射0.8 m1,1.0 ml上述提取液，观察小鼠症状。
小白鼠生物检测法结果与讨论
• 结果 • 小白鼠经腹腔注射四种溶剂提取的河豚内脏提取液后，均 呈现中毒症状，观察症状如下:注射0.8 ml样品液的小鼠最 初表现平静，过30 min左右开始浑身打颤，最后身体上的 毛都湿了。但经过5-6 h后，又恢复平静。随着时间的延 长，小鼠也恢复正常，大约一天的时间，小鼠完全恢复正 常。而注射1 ml样品液的小鼠最初也是表现为平静，继而 出现不安，突然旋转，大呼吸，最后突然跳起，翻身，四 肢痉挛，腹部朝上死亡。该死亡症状与文献报道的河豚毒 素中毒死亡症状一致。小白鼠的死亡时间却不一致，2,3,4 号提取液致死时间几乎相同，且时间较长为6-8 h，而1号 提取液对小白鼠的致死时间相对较短为4一5 h。
3、提取、分离和检测技术
• ①材料：棕斑腹刺豚。 • ② TTX的提取 • 取河豚鱼的内脏捣碎后，分为四份，分别加入5倍量的甲 醇、乙醇、乙酸、水，然后将装有四种不同溶剂的提取瓶 置于60℃恒温水浴锅中8h，使TTX充分溶解于溶剂中。
③分离
• 取出三角瓶，3500 rpm离心10min，分别收集上清液和固 体物，将固体物再重复以上步骤2次，合并上清液。若脂 肪过多可用乙醚进行脱脂处理。将上述粗提液减压蒸馏。 得到的少量液体按照溶剂的不同编号为1号(乙酸提取),2号 (甲醇提取),3号(乙醇提取),4号(水提取)处于冰箱中备用。
• 参考文献：
杨春,苏秀榕,李太武等.低毒河豚鱼毒素的提取和检测[J].天然产物研究与 开发 ,2003-10-30 岳亚军; 张律; 游杰等免疫亲和柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定鱼 肉和肝脏中河鲀毒素[J]，中国食品卫生杂志，2016-03-30 扇贝中麻痹性毒素的提取与分离纯化林华娟“，秦小明中的麻痹性贝类毒素[J]，海洋 环境科学,2016-04-20 江涛,双壳贝类中麻痹性贝类毒素的提取、分离和检测技术研究[J],暨南大 学,2006-05-01 姚建华,贝类毒素液相色谱—串联质谱检测技术的建立与应用[J], 上海海 洋大学,2010-06-06 刘栋,高效液相色谱—串联质谱法检测多种贝类毒素研究[J],辽宁大 学,2013-05-01
③分离
•将混合物移至量筒中并稀释至200mL。将混合物倒回烧杯， 搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状。利用超速离 心机，将混合物或上清液以3 000r/min离心5min。或者用滤 纸过滤。
④鉴定方法
a、小白鼠生物检测法 PSP的小鼠生物法检测程序已由美国分析化学家协会 (AOAC)标准化(AOAC,1990)，并在世界范围内被广泛接受。 虽然小鼠生物法操作简单、能反应样品总的毒性，但也有很 多不足的地方，如只能检测毒性大小，而无法确定毒素的种 类和含量;小鼠的不同品系、批次、大小对毒素的测定的灵敏 度有很大的影响;实验结果可重复性、可比性差。
海洋生物毒素的提取、分离和鉴定
---------------------以麻痹性贝毒、河豚毒素为例
一、麻痹性贝毒
1、来源 有害赤潮特别是有毒赤潮对人类生命健康和海洋生态系统的 威胁日益严重，已引起人们的广泛关注。有毒赤潮藻类可产 生多种毒素，这些毒素可通过食物链在贝类或鱼类等生物体 内累积放大，当人们误食这些染毒的海产品时，就会发生中 毒死亡，因此，这些毒素又常被称为贝毒素或鱼毒素。
4、提取、分离和检测技术
①样品采集
扇贝采集，样品采集后现场用水冲净外壳，并用不锈钢刀打 开，将贝肉、性腺和消化腺分离，用纱布吸除多余水分，然 后冰块保存运至实验室，- 20 度贮存。
②提取
• 贝类PSP的提取方法主要采用AOAC法，该方法简单描述 为: • a、在称重的烧杯中称取100g均质的样品，加0. lmol/L HCl 溶液100mL充分搅拌，检查pH (pH应为2. 0-4. 0，以3最佳)。 需要时，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0. lmol/L NaOH溶液 调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱 化破坏毒素。 • b、将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节 pH至 2. 0-4. 0(勿>4. 5)。
3、物理化学性质
a、通常情况下，PSP毒素化学性质比较稳定，但在碱性水 溶液中容易发生分解; b、在强酸性水溶液中，部分毒素容易发生转化，例如N一 磺酞氨甲酞基类毒素在加热、强酸性条件下会脱掉磺酞基， 生成相应的胺基甲酸醋类毒素。 c、在pH为2-4，尤其pH=3时毒素最为稳定，在一18℃以下 能够较长时间保存; d、麻痹性贝毒本身紫外吸收很弱，且不能产生荧光，但其 在碱性条件下氧化再酸化能生成荧光物质，这种性质成为 PSP荧光检测的主要依据。
b、薄层层析法
• 硅胶板的制作：称取硅胶H 50g于研钵中，加入25 ml 0.5%的CMC，在研钵中研磨混匀至糊状无颗粒将其倒在 层析板上，平铺均匀，(这样可铺三块长17 cm、宽12 cm 的层析板)于110℃活化半小时后取出备用。 • 点样:20川样品液点于活化好的硅胶板上，点样点距离板 底1.5 cm，点样斑点直径控制在2~左右，样品间距约1.5 cmo • 展层:首先将展开剂置于层析缸中5 min预平衡，再将点好 样的层析板放人层析缸中室温展开(展开剂为正丁醇:醋酸: 水=2:1:1)，待展开剂前沿走至距板顶1. 0 cm时取出，自 然晾干。 • 显色:用喉头喷雾器将3 mol /1 KOH溶液均匀喷至层析板 上，吹风机吹干，于160℃下烘15一20min，取出10 min 后立即扫描。
感谢您的聆听！！！
2、河豚毒素简介
• 70年代成功的从河豚鱼体内有毒部位(卵巢、精巢、肝脏、 脾、胃、肠等)分离提纯河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX)。 TTX是一种结构为笼形原酸脂类的非蛋白神经毒素，其分 子式为C11H17O8N3，分子量为319。 • 河豚毒素呈白色结晶状，无臭，易潮解，在镇痛、降压、 抗心率失常、局麻、戒毒、抑瘤等方面发挥着不可替代的 医疗作用，因此具有极高的经济价值和医疗价值。由于河 豚毒素能特异性阻断钠离子通道，在生理研究上，已成为 机制研究的工具药，为神经细胞膜研究必不可少的标准药 物.
针对PSP的仪器检测方法还有液相色谱一质谱联用，毛细 管电泳法，流动注射法等，但都因灵敏度低或毒素组分分离 度差等原因而未能得到广泛使用。
二、河豚毒素
1、河豚简介 河豚鱼(Balloonfish )，属硬骨鱼纲、鱿形目。世界上有200 多种，可引起中毒的有9种。河豚主要分布在渤海、东海、 黄海及江河下游，为近海与河川底层肉食性海产有毒鱼类。 河豚鱼肉质细嫩、鲜美，曾有“拼死吃河豚”之说，吃河豚 中毒死亡者，在国内外屡见不鲜，就是食用河豚经验比较丰 富的日本人，据说每年中毒死亡者也有几百人之多。