摘要：目的研究反硝化聚磷茵除磷特性，筛分同时具有反硝化和吸磷能力的菌种．方法采 用平板分离和ＤＧＧＥ技术相结合，对实验室反硝化除磷系统菌种进行分纯和菌种鉴定，并对 富集培养后的每株单茵分别进行反硝化吸磷效果试验．结果最终共得到１５株单菌．结果表明 有１ｌ株菌均具有不同程度反硝化吸磷能力，其中假单胞茵属的ＪＢ２和产碱菌属的ＪＢ３脱氮除 磷效果最好，８ ｈ后磷的去除量分别为１３．７６ ｍｇ／Ｌ和１１．８５ ｍｇ／Ｌ．ＤＧＧＥ试验结果表明，系统 中反硝化聚磷茵优势种群可主要分为７个群，分别是Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅ— ｒｏｉｄｅｔｅｓ，ＴＭ７，理一ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，８一ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ和ｙ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ菌群．结论Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅ— ｍ中的ＬＢ９号菌和ｙ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ中的ＪＢ２号茵为反硝化除磷系统中占优势的反硝化聚 磷茵．试验结果同时证明同一菌种可以同步完成反硝化和吸磷任务．
在前８ ｈ的吸磷量仅为０．４２ ｍｇ／Ｌ和０．６６ ｍｅ，／ ＪＬ７、ＪＢ２、ＪＢ３和ＪＢ４ ６株具有反硝化能力，而其
ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ，ＴＭ７，ａ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ， 艿一ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ和ｙ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ菌群．经平 板分离、除磷和ＤＧＧＥ试验，确定属于ｙ—ｐｒｏ— ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌属的ＪＢ２菌株和Ａｃｔｉ－ ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ的ＬＢ９为反硝化除磷系 统中的优势反硝化聚磷菌．
（３）变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分析； （４）克隆测序．
２试验结果与讨论
２．Ｉ菌种分离鉴定结果 ２．Ｉ．１ 反硝化菌的分离鉴定
利用反硝化菌培养基得到６株具有明显反硝 化效果的反硝化菌，生理生化试验和检索结果表 明，这些菌种分别属于ＬＢ２弧菌科（Ｇａｍｍａｐｒｏ－ ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科）、ＬＢ３肠杆菌科 （Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科）、 ＬＢ４假单胞菌属（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｐｓｅｕｄ— ｏｍｏｎａｓ科）、ＬＢ５肠杆菌科、ＬＢ８气单胞属（Ｇａｍ－ ｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科）、ＬＢ９微 球菌属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ科）． ２．１．２聚磷菌分离鉴定结果
（Ｉ）基因组ＤＮＡ的提取 采用无菌移液管于反应器中部吸取２ ｍＬ活 性污泥，立即置于冰上，用于总ＤＮＡ的提取．取 ０．５一１．０ ｍＬ污泥置于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，转速 １０ ０００离心ｌ ｍｉｎ，弃去上清液，获得污泥沉淀 Ｏ．２５—０．５ ｍｇ，采用Ｍｏｂｉｏ土壤ＤＮＡ提取试剂 盒（Ｍｏｂｉｏ，ＣＡ ＵＳＡ）提取总ＤＮＡ，最终溶解于
利用硝酸根为电子受体吸磷的能力．
和０．９１ ｍｇ／Ｌ，２０ ｈ后的吸磷量达到了３．３２ ｍｇ／ ２．２．２聚磷菌的吸磷试验
Ｌ、４．６４ ｍｇ／Ｌ、２．４９和２．７４ ｍｇ／Ｌ；弧菌科的菌株
试验中发现９株聚磷菌好氧吸磷能力都很
ＬＢ２和气单胞菌属的菌株ＬＢ８的吸磷能力较弱， 强，但是通过生理生化试验发现只有ＪＬ２、Ｊ１．，４、
关键词：反硝化菌；聚磷菌；平板分离；ＤＧＧＥ
中图分类号：Ｘ１７２
文献标志码：Ａ
Ｏ引 言
聚磷和反硝化是污水生物除磷脱氮过程中两 个十分重要的反应过程，随着除磷脱氮技术在微 生物领域研究的不断深入，聚磷菌和反硝化菌也 逐渐被人们认识和了解¨。２］．有学者认为在传统 的除磷脱氮工艺中，不动菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ）是除 磷菌中占优势的菌种∞Ｊ，假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏ· ｍｏｎａｓ）则是反硝化菌中占主导地位的菌种＂。．８０ 年代中期至今反硝化吸磷现象已经被人们所确 认，并且Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等（１９９５）从微生物学角度也 证实了同一菌种能够完成反硝化同时吸磷的任 务，但是他同时也指出，聚磷菌中的Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ 并不具有反硝化能力∞ｊ．而且另有研究表明 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ在除磷系统中数量上并不占优 势Ｍ Ｊ．目前普遍认为除磷菌的种类是多样的，很
多菌种都具有聚磷能力，但是还存在很多问题没 有解决．譬如利用传统分离技术分离聚磷菌种类 很有限；而利用分子生物学手段得到的诸多菌种 缺少生理生化方面的验证等问题＂Ｊ．
笔者利用传统的平板分离技术和ＤＧＧＥ技 术相结合，对实验室反硝化除磷系统聚磷菌菌群 结构组成、菌种生理生化特性进行了深入研究．最 终得到具有反硝化效果的反硝化菌６株，聚磷菌 ９株．同时分析认为系统中反硝化聚磷菌优势种 群可主要分为７个群，分别是Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ，Ａｃｔｉ—
反硝化菌和聚磷菌共１５株，各类菌种所占菌 种总数（划分到纲）比例如图ｌ所示．
图１各类菌种所占菌种总数比例
Ｏ ９ ８ ７ ６ ５
（１奄Ｅ芰ｈ＾）ｄ一文 ４
３
２●
在这１５株菌中，经鉴定有６株属于Ｇａｍｍａ－ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ种，占总数的４０％，Ｂａｃｉｌｌｉ和Ｂｅｔａｐ－ ｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ各４株，占２６．７％，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ占
ＧＣＴ ＧＧＣ一３’）（ＧＣ夹序列为：５’一ＣＧＣ ＣＣＧ
ＣＣＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＧＣＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＣ
ＣＣＧ ＣＣＣ Ｇ一３’）．ＰＣＲ反应体系１００止的ＰＣＲ 反应体系组成如下：１０×ｂｕｆｆｅｒ １０止（ｐｌｕｓ Ｍ９２＋），１０％ＢＳＡ １此，引物各３ ｐＬ（２．４ ＩｘＭ），
ｄＮＴＰ ８ ＩｘＬ（８００斗Ｍ），Ｅｘ Ｔａｑ酶３．２ Ｕ（宝生物， 大连），模板５０ ｎｇ一１００ ｎｇ．ＰＣＲ反应条件反应程 序为：预变性９４℃，５ ｍｉｎ；并接以３０个循环包 括，９４℃变性４０ Ｓ，５３℃退火４０ Ｓ，７２℃延伸 ｌ ｍｉｎ，循环完毕，７２℃延伸５ ｍｉｎ．采用琼脂糖电 泳分析ＰＣＲ产物的浓度和质量；
ＣＨ３ＣＯＯＮａ·３Ｈ２０，２８．７３ ｍｇ Ｎａ２ＨＰ０４·２Ｈ２０， ５７．２７ ｍｇ ＮＨ４ＣＩ，１３１．８２ ｍｇ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０， ２６．７４ ｍｇＫ２Ｓ０４，１７．２ ｍｇ ＣａＣｌ２·２Ｈ２０，１２ ｇ
ＨＥＰＥＳ缓冲溶剂，１５ ｇ琼脂和２札微量元素，
ｐＨ７．０．微量元素构成：每升蒸馏水加人５０ ｇ ＥＤ·
６．６％．
２．２菌种反硝化吸磷试验结果 利用两种培养基分离出６株反硝化菌和９株
聚磷菌，共１５株菌，其中聚磷菌中ＪＬ２、ＪＬ４、ＪＬ７、 ＪＢ２、ＪＢ３和ＪＩＭ ６株具有反硝化能力，而其中ＪＬ４ 菌株的扩大培养没有成功，因此，本试验中只考察
了ＬＢ２、ＬＢ３、ＬＢ４、ＬＢ５、ＬＢ８、ＬＢ９、ＪＬ２、ＪＬ４、ＪＬ７、 ＪＢ２、ＪＢ３和ＪＢ４ １ １株菌株的反硝化吸磷特性． ２．２．１ 反硝化菌种的反硝化吸磷结果
２００９年０５月 第２５卷第３期
沈阳建筑大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｊｉａｎｚｈｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
文章编号：１６７１—２０２１（２００９）０３—０５３５—０６
Ｍａｙ ２００９ Ｖ０１．２５，Ｎｏ．３
反硝化聚磷茵菌种筛分与除磷特性分析
收稿日期：２００７—０９—２０ 基金项目：国家自然科学基金项目（Ｅ０８００４０２）；北京市水质科学与水环境恢复工程蕈点实验室开放基金项目
（０８ＵＷＨＣｌ０）；城市水资源与水环境国家重点实验室开放基金项目（０８ＵＷＨＣｌ０） 作者简介：焦中志（１９７６一），男，博士后，主要从事污水处理及污水资源化方面研究．
对缺氧池内的聚磷菌进行了二次分离，第一 次采用了直接对活性污泥进行稀释、分离和纯化 的方法，第二次采用先富集培养后分离的方法，两 次共分得９株聚磷菌．其中几ｌ、ＪＬ２、ＪＬ４、ＪＬ５、 ＪＬ７为第一次分得，ＪＢｌ、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４为第二次 分得．生理生化试验和检索结果表明这些菌种分
万方数据
第２５卷
６株具有明显反硝化效果的反硝化菌吸磷试 验结果如图２（ａ）、（ｂ）所示．
３ ２ ｌ Ｏ ９ ８ ７ ６ ３瓷ｇ董一ｃ弓ｑ ５ ４ ３ ２ ｌ
ｔｌｈ
（８）６株反硝化菌吸磷曲线
ｔｌｈ
（ｂ）６株反硝化菌硝酸氯降解曲线
圈２反硝化菌反硝化吸磷效果
从图２（ａ）、（ｂ）可以看出这６株反硝化菌在 始下降．对应图２（ａ）、（ｂ）还可以看出，磷酸根的
将分离出来的反硝化菌和聚磷菌富集培养， 在限磷培养液（Ｐｑ＋≤４ ｍｇ／Ｌ）中厌氧培养２４ ｈ，然后在富含磷和ＮＯ；的培养液中厌氧培养２０ ｈ以上，检测培养液中硝酸氮和磷的质量浓度变 化．ＮＯ，－一Ｎ采用麝香革酚分光光度法，ＰＯｉ一一Ｐ 采用氯化亚锡还原光度法． １．４ ＤＧＧＥ试验
对不同碳源条件下反硝化除磷系统污泥样品 进行分析：
反硝化的同时都具有不同程度的吸磷能力．肠杆 吸收和硝酸根的降解对应并不明显，这类菌株反
菌科的两株菌ＬＢ３、ＬＢ５，微球菌属的ＬＢ９和假单 硝化的能力要远超出其吸磷能力．但利用反硝化
胞菌属的菌株ＬＢ４的吸磷能力较强，在前８ ｈ的 菌培养基培养出来的这６株菌，都具有不同程度
吸磷量分别为１．７４ ｍｇ／Ｌ、２．１６ ｍｇ／Ｌ、１．０ ｍｇ／Ｌ
ＴＡ，５ ｇ ＦｅＳ０４·７Ｈ２０，１．６ ｇ ＣｕＳ０４·５Ｈ２０，５ ｇ ＭｎＣｌ２·４Ｈ２０，１．１ ｇ（ＮＨ４ ６ Ｍ０７０２４·４Ｈ２０，
５０ ｍｇ Ｈ３８０３，１０ ｍｇ ＫＩ和５０ ｍｇ ＣｏＣｌ２·
６Ｈ２０［８１．
１．２分离与鉴定 分离采用平板分离法一Ｊ．对分离纯化后的菌
株进行革兰氏染色，葡萄糖氧化发酵，接触酶，氧 化酶等一系列生理生化实验，然后进行检索鉴 定‘１ ０｜． １．３反硝化吸磷试验分析方法
（２）基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增 使用Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ的ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００型基因扩增仪．以大多数细菌和古细 菌的１６ＳｒＲＮＡ基因Ｖ３区通用引物扩增引物