桥抗生物素-生物素技术(Bridged Avidin-Biotin technique, BRAB技术)
标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)
2.差异大,注意厂家、批号
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP约为10,中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.
2.Avidin是glycoprotein,与lectins等分子通过碳水化合物连接
•通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素)代替avidin克服上述缺陷.
3.标本:不能太厚
4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合
5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
间接法(Indirect)
基本原理
•以间接法法为例
•阳性对照：已知阳性
•阴性对照：
1.已知阴性
2.空白对照BS代替特异性抗体
3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体
4.吸收实验:先用抗原吸收一抗
5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体
6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗
Antibody Detection
• There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
•光源寿命有限,应集中观察,防止反复点燃,灯熄后应充分冷却才能再次点燃,一次观察时间不能太长,以2-3h内为宜
•标本染色后应尽快观察,存放在4C能延缓荧光衰减,标本不能长时间暴露于紫外线
荧光显微镜标本制作要求
1.载玻片:厚度均匀,0.8-1.2mm之间,光洁,无自发荧光
2.盖玻片:厚度0.17mm,光洁
•一抗是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80-90%多抗由家兔制得，单抗由小鼠制备）
•二抗为一抗（IgG）的抗体。
•优点：只要一抗来自同一种属，同一标记的二抗就能用来显示不同的抗原，避免了直接法标记每一种一抗，提高了敏感度。
酶标抗体法的特点
•用于标记的酶应具备以下几点:
1.酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，易于光、电镜观察
抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与抗生物素、SPA与IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。
• Avidin-Biotin interactions or other commercially-available amplifiers
生物素-抗生物素基本原理
• Avidin卵白素，统称为抗生物素或亲和素a basic glycoprotein，MW 68 Kd
7.载体蛋白抗体:制备半抗原的抗体时,使用了载体蛋白,用固相吸收技术将载体蛋白抗体除去
增加染色强度方法
1.重复显色
2.重复一抗
3.双桥PAP法
亲和组织化学（Affinity histochemistry）
•新技术的出现----新进展
•特点一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(Lectin)、生物素（Biotin）和葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein, SPA）等被应用于ICC，其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高亲和力为基础。它们既有别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，本质上又非抗原抗体反应。称为亲和组织化学（Affinity histochemistry）。广义的亲和组织化学包括：
Antibody Staining
• Primary antibody may be directly labeled
• labeled secondary antibody or more complex detection system.
• secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase ,PAP法)
•原理与酶桥法相似
•制备PAP复合物:使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物
PAP复合物的特征
•在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物
• PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响
• PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构
• Streptavidin: a protein (MW 60 Kd) isolated from the bacterium Streptomyces avidinii(链霉亲生物素蛋白), and like avidin, has four high affinity binding sites for biotin. IP接近中性,在中性pH时很少带电荷, not a glycoprotein and therefore does not bind to lectins.
1）脱蜡、水化组织切片。
2）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）
3）蒸馏水漂洗，置于TBS中。
4）阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）
5）蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟
6）一抗孵育10-30分钟
7）TBS漂洗10分钟
8）EnVisionTM孵育10-30分钟
9）TBS漂洗10分钟
减少或消除非特异性染色的方法
•最常见原因蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上
•最有效方法
1.在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1:5-20）10-20min，
2.加入2-5%牛血清白蛋白可进一步减少非特异性染色，
3.用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）
对照实验
主要是针对第一抗体对照，常用方法：
10)色源底物溶液孵育10分钟
11)蒸馏水漂洗
12)复染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
•抗原抗体反应
•标记化学反应
•呈色化学反应
要求
待检标本形态结构
和抗原性保存良好,Байду номын сангаас
抗原不从原位扩散
或丢失
Specimen preparation
取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏
2.所形成的终产物必须稳定,不能弥散
3.较易获得,价廉,最好已商品化
4.组织中不应存在内源性酶或类似物质
5.酶应稳定,标记后保持酶和抗体的活性
缺点酶与抗体共价结合损害部分抗体和酶的活性
三步法(HRP labelled)
多层反应法
Alkaline Phosphatase - Anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) Technique
免疫组化常用方法
二步法：EnVision System
EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即
EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。
EnVision工作程序：
1. Fluorescence
2. Enzyme-Mediated Detection
3.亲和组织化学（Affinity histochemistry）
1. Fluorescence
Directly Indirectly
直接法间接法
补体法
双标法
使用荧光显微镜的注意事项
•暗室
•点燃汞灯5-15min,稳定后再开始观察
PAP法的评价
•抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性
•灵敏度高:3个酶分子对应1个抗原
•不适合免疫电镜AP复合物分子量大
•背景染色低
假阴性及其处理
假阳性及其处理
1.组织细胞内色素:如神经黑色素,可用AKP代替HRP
2.假过氧化物酶活性:如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)
• biotin生物素，small water soluble vitamin（vitamin H），MW 24Kd，
• Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高（较抗原抗体高100万倍）的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。
3.内源性过氧化物酶活性:如粒细胞、巨噬细胞等，用AKP代替HRP
4.游离醛基:与蛋白质(含IgG)非特异性结合,用白蛋白预孵育封闭之
5.疏水键和离子键: Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合,用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之
6.天然抗体及不纯抗体:增加一抗稀释度
• Fixation
• Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrieval Techniques
• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .