实验1 生化实验基本操作一、生化实验特点介绍生化的重要性和有趣性，引起学生对生化课的兴趣，帮助学生树立正确的实验态度1、简介生物化学学科特点：1）一门在分子水平上研究和探索生命现象和本质的学科，发展迅速，进展快，是生命科学的领头羊，其理论和技术已渗入到医学各学科，二十一世纪被称为分子生物学时代，这门学科的发展，已很大程度上改变着人类的生存状态，但仍有很多未知领域。

2）从同学们关心的角度（考研）说明生化的重要性。

3）是一门实验性学科，每一理论的提出都来自于科学实验，实验本身是这门学科的基础和重要组成部分，是探究问题的重要途径，培养我们发现问题、分析问题解决问题的能力，而非机械的操作（多问为什么！多想怎么办！）。

2、生化实验的特点：1）主要运用化学的原理和方法设计的科学实验。

2）生化实验拥有先进的实验手段。

3）微量和定量是生化实验的一大特点。

二、生化实验室规则让学生树立科学正确的实验意识，培养基本的科研素养。

1、实验前：认真预习，有自己的见解，提出实验思路和问题。

2、实验中：认真操作，仔细观察，如实纪录。

养成良好的科学实验习惯，注意安全。

3、实验后：独立完成实验报告，分析结果和出现的问题，培养分析解决问题的能力。

离开实验室时，清点仪器，安排值日，检查灯火水电气等。

三、生化实验基本操作1、玻璃仪器的清洗：（开始实验的重要步骤，是实验能否成功的重要因素）一般玻璃仪器：（如试管，烧杯）自来水冲洗—肥皂水刷洗—自来水冲洗—蒸馏水淋洗—干燥（倒置风干）容量分析仪器：（如吸量管，滴定管）自来水冲洗—铬酸洗液浸泡—大量自来水冲洗蒸馏水淋洗—干燥比色杯：自来水冲洗—酒精或盐酸浸泡—自来水冲洗—蒸馏水淋洗***注：切忌用试管刷、粗布擦洗，分清毛面光面，手拿毛面。

清洁标准：对光面玻璃璧上有均匀的水膜，倒置不挂水珠。

教学内容与组织安排：2、吸量管的种类及使用分类：奥式吸量管，移液管，刻度吸量管（实验中要根据情况选取合适的吸量管）刻度吸量管：全流出式（刻度到尖端，吹）和不完全流出式使用：执管；取液（忌悬空）；调准刻度（液体凹面，视线，刻度平行）；放液（管尖贴内壁）；洗涤。

4、微量可调式移液器的使用调节所需体积值；套枪头；垂直持握，大拇指按至一档取液；排液按至一档后继续至二档；移取另一液体时更换枪头。

5、溶液的混匀旋转混匀法：手持，手腕，离心运动。

（适用于未盛满液体的试管或锥形瓶）指弹法：左手持试管上端，右手轻弹试管下部。

颠倒混匀法：适用于有塞的容量瓶。

吸量管混匀法：用吸量管将溶液反复吸放数次。

玻璃搅动法：常用于固体试剂的溶解和混匀。

6、离心机的使用BS原则平衡（balance）对称（symmetry）实验2糖的颜色反应[实验目的及要求]1.掌握莫氏试验鉴定糖的原理和方法；2.掌握塞氏试验鉴定酮糖的原理和方法3.掌握杜氏试验鉴定酮糖的原理和方法.[实验原理]1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。

2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。

3．杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。

[实验仪器及用品]仪器：水浴锅器皿：吸管、试管实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。

[实验内容及步骤]一、莫式实验于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。

二、塞式试验于4支试管中，分别加入0.5 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加莫式试剂2滴，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。

三、杜式试验于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。

将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。

三、实验现象记录仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。

[实验注意事项]1．试管中加入各种糖后，做好标记，并按顺序放到水浴锅中；2.实验过程中，要仔细观察溶液的颜色变化情况。

[实验报告要求]1.写好预习报告，包括实验目的与要求、实验原理、重要的实验器材及试剂、实验步骤。

2．做完实验后，把所观察到的实验现象记录在实验报告上，并做相应的解释。

实验3蛋白质及氨基酸的呈色反应一、目的：1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。

2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

二、呈色反应：（一）双缩脲反应1．原理：素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。

双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。

可用于蛋白质的定性或定量测定。

双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。

含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团NH2 NH2的物质以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物质也有此反应。

NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。

因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

2．试剂：①尿素②10%氢氧化钠溶液③1%硫酸铜溶液④2%卵清蛋白溶液3．操作：取少量尿素结晶，放在干燥试管中。

用微火加热使尿素熔化。

熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。

冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。

观察出现的粉红颜色。

要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。

向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。

观察紫玫瑰色的出现。

（二）茚三酮反应1．原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。

β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。

尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。

因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。

在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。

该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。

茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。

此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。

2．试剂：①蛋白质溶液2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）②0.5%甘氨酸溶液③0.1%茚三酮水溶液④0.1%茚三酮-乙醇溶液3．操作：①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。

②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。

（三）黄色反应1．原理：含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。

反应式如下：多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

2．试剂：①鸡蛋清溶液将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1∶20混匀，然后用6层纱布过滤。

②大豆提取液将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。

③头发④指甲⑤0.5%苯酚溶液⑥浓硝酸⑦0.3%色氨酸溶液⑧0.3%酪氨酸溶液⑨10%氢氧化钠溶液3．操作：向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。

待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。

1．写出蛋白质中可以与双缩脲试剂反应的化学基团的名称及化学结构。

2．一个分子中必须有几个上述化学基团才能给出双缩脲反应的阳性结果？双缩脲试剂与二肽和三肽都能进行反应吗？3．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解作用进行的程度作出什么结论？4．如果蛋白质中的氨基酸的平均分子量为125，在分子量为150000的蛋白质分子中存在着多少个上述化学基团？5．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。

6．你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。

7．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？8．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？9．是否所有氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果？为什么？是否大部分蛋白质呈现阳性结果？为什么？实验4 蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、目的1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

1、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

二、原理蛋白质是两性电解质。

在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

当溶液的PH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。

不同蛋白质各有特异的等电点。

在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。

向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。