花椰菜花球发育和成花启动中分生组织特定基因的表达研究摘要：当发育停滞在一个特定的时期，青花菜和花椰菜生殖发育的调控与普通时期是不同的。

青花菜和花椰菜的花球分别是花序分生组织和花芽的一部分。

为了确定这种停滞是否与拟南芥中调控基因相似，我们研究了与拟南芥同源的几个基因（BoAP1-a, BoAP1-c, BoCAL, BoFUL-a, BoFUL-b,BoFUL-c, and BoFUL-d; 和 BoLFY, AP2, UFO, 和BoTFL1）和青花菜花球发育特异基因CCE1和BoREM1。

BoFUL 和 BoLFY转录水平在花椰菜发育停滞期达到最大，这些基因在花分生组织启动中起作用。

其他基因的表达与发育停滞时期无关。

通过BoCAL, BoAP1-a,或 BoLFY 的抑制效应来维持花分生组织的发育停滞的模式是不确切的。

在boap1-a boap1-c bocal三突变体的花原基和花芽是正常的，因此成花启动是由其它基因调控的。

BoTFL1在拟南芥中的一个抑制成花的基因却不抑制花椰菜花原基的形成。

花椰菜和青花菜中花原基的启动和花芽的增大不单单只是由与拟南芥所同源的基因调控的。

关键词：花椰菜，青花菜，发育停滞，开花，花分生组织决定基因，温度1前言甘蓝有许多品系和各种各样的可食部分。

生殖发育决定了作物的价值，但这个过程的主要步骤的生理和基因的机理了解甚少。

甘蓝花球的表型与花絮分生组织有联系。

花絮分生组织分担了植物生长和生殖极点。

在西兰花中，生长的抑制在开花和顶端形成花球之前。

一些研究已经试着通过识别并描绘拟南芥花的同源异性基因的同源性来说明花椰菜生长停滞是基因控制的。

在拟南芥中LEAFY(LFY)基因的过量表达及造成的TERMINAL FLOWER 1 (TFL1)表达的抑制通过上调APETALA 1 (AP1)和CAULIFLOWER(CAL)这两个基因来启动开花的。

甘蓝的同系物不是直接与拟南芥功能平行表达的。

花椰菜BoLFY表达的起始不是与花原基起始相关的。

一些证据表明BoAP1 和 BoCAL是发育停滞的最初调控因子。

CAL等位突变对花椰菜的影响造成拟南芥AP1突变体有甘蓝的表型。

Kempin等指出这种突变体造成了甘蓝中花椰菜的表现型。

野生型的BoCAL等位基因的发现证明了这个平行性。

BoAP1-a 和 BoCAL在青花菜和花椰菜杂交的双单倍体分离群体中生长停滞有增加效用(Smith and King, 2000)。

功能和非功能等位基因的的系统发育的分配与BoAP1-a 和 BoCAL对甘蓝花发育是必须的(Lowman and Purugganan 1999)。

最后，BoAP1-a在花椰菜花芽启动的地点积累。

也有证据表明发育迟滞是很复杂的，同时指出BoAP1-a 和 BoCAL虽然在花球中但不能预测在其他群体的表现型。

在甘蓝和没有花球的芸薹属植物中BoCAL 的等位突变已经获得过，野生型的等位基因BoCA L也在花椰菜中发生(Smith and King, 2000)。

随后对甘蓝研究和花椰菜登记仅仅发现了BoAP1-a 和 BoCA与花椰菜表现型的联系很不紧密(Labate et al, 2006)。

此外，与花球相关的位点，就像发芽和发芽到开花，有86个位点影响(Lan and Paterson,2000)，暗示了花椰菜发育停滞是受多基因控制的。

现阶段研究的主要目标是确定在花椰菜生殖发育阶段发育停滞的控制基因有哪些。

通过对拟南芥开花控制基因的研究而找的花椰菜和青花菜开花控制基因的候选基因。

这些候选基因从拟南芥分生组织确定基因中选出，包括从花序分生组织到花原基。

这些花器官确定因子有：LEAFY (LFY), APETALA 2 (AP2),UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), and the MADSbox genes APETALA 1 (AP1), CAULIFLOWER (CAL),and FRUITFULL (FUL) (Bowman et al., 1993; Shannon and Meeks-Wagner, 1993; Ferrandiz et al., 2000), 和在花椰菜中维持停滞的花抑制因子 TERMINAL FLOWER 1 (TFL1)。

其他两个与花椰菜花球特别相关的基因是CAULIFLOWER CURD EXPRESSION 1 (CCE1) 和REPRODUCTIVE MERISTEM 1 (BoREM1)。

CCE1可能是维持发育停滞的潜在基因，而BoREM1可能会打破这种停滞而继续生殖发育。

我们可以使用荧光实时定量PCR来分析，这项技术有足够的灵敏性来探测低水平表达的基因。

这项研究之所以新颖是因为其调查了在不同生长停滞时期基因的表达变化。

而且，正是因为花椰菜的MIGs的多拷贝使我们研究哪一个基因是重复的。

花球发育和停滞受温度影响。

低温促使花的发育，而高温阻止生殖发育。

在青花菜和花椰菜的的繁殖中温度会影响经济效益和备受关注。

花椰菜的花芽在低温下造成了“很好的”花球，而过多的热量会阻止花球的发育并促使苞叶和小苞叶发育(Booij and Struik, 1990; Fujime and Okuda, 1996; Bjo¨rkman and Pearson, 1998; Grevsen et al., 2003, Kop et al., 2003)。

这里我们运用温度的作用特异的诱导发育停滞阶段。

在拟南芥和花椰菜的研究表明了温度在MIGs起很大作用。

在拟南芥中，高温下AP1和LFY的表达量增加(Bowman et al., 1993)。

在花椰菜中高温造成了茎顶端BoLFY 和 BoAP1的表达下调(Anthony et al., 1996)。

而且，BoAP1-a在苞叶中与温度有关的位点已经找到。

虽然，BoAP1-a的等位基因的状态对苞叶生长有很大的影响，在同一基因型中高温也会增加苞叶的生长(Kop et al., 2003)。

这项研究分清了MIG的表达是否与温度或者发育阶段有关。

2材料和方法2.1植物材料和生长条件2.1.1实验Ⅰ：同一基因型的花椰菜在不同发育阶段的基因表达。

2.1.2实验Ⅱ：花椰菜在不同温度同一发育时期的基因表达2.1.3实验ⅢBoAP1 和BoCAL对BoFUL and BoTFL1表达的影响2.1.4 RNA的提取和反转录2.1.5基因表达2.2统计分析3结果3.1 实验Ⅰ：同一基因型的花椰菜在不同发育阶段的基因表达。

“蜜绿F1”对温度变化非常敏感。

所以在生殖启动时期通过运用温度变化来创造花芽停滞的表现型（图1）。

图1.温度对花椰菜发育停滞时期的影响。

生殖发育期3种不同的白天/晚上温度条件下生长的“蜜绿F1”。

（A）在16℃ /12 ℃，花球在花芽时期停滞（青花菜状）。

（B）在22℃ /17 ℃条件下，生长停滞在花原基时期（花球中间期）。

（C）在28℃ /22 ℃条件下，花头在花序分生组织时期停滞（花椰菜状花头）。

我们研究了所有基因的相对表达量，在对照组和其他两个处理之间。

BoAP1-a 和BoAP1-c在花原基启动时期显著积累。

在花原基中与花序分生组织比较中发现，BoAP1-a 和 BoAP1-c分别上调了23和21。

这种表达在花芽停滞时期也得以维持（图2）。

BoCAL在花序分生组织-花原基时期达到最大，以后开始显著下降(P=0.02)（图2A）。

AP2的转录在花芽期达到最大。

BoLFY在花序分生组织和花原基时期表达量相差不多。

而在花芽期表达量更低（F=8.5）。

BoLFY在生殖发育初期达到最大。

BoTFL1从花原基到花芽期时表达量下调（F=2.1）（图2B）。

boap1-a boap1-c bocal 三突变体的 蜜绿F1也可以形成花芽好完整的花。

候选基因特别是花启动基因是FUL 或者UFO。

BoFUL的4个同源类似基因在所有的时期都表达。

BoFUL-c 和 BoFUL-d是四者中表达量最大的。

BoFUL-b、 BoFUL-c、和BoFUL-d在花序分生组织时期表达量达到最大。

但是在花序分生组织到花芽期它们的表达显著下降（F=6.4、3.66/4.23）。

BoFUL-a与其他三个略有不同。

其表达量在花分生组织时期达到最大而且可以维持到花芽期。

在这一时期，基因表达以F=2显著下调（图2C）。

UFO在每一个时期的表达量都很低，而且每一期的差异都不明显（图2D）。

我们研究了与花椰菜花球形状特别相关的2个基因。

CCE1在花序分生组织和花芽分生组织的表达量相等。

然而其在花芽中的表达量很低（F=110）。

BoREM1在花原基中比在花序分生组织中低4.2倍，比花芽中低4.9倍。

图2.花椰菜基因的相对表达。

蜜绿F1在三个时期发育停滞。

左：在中间发育停滞时期的相对基因表达[花原基]与花椰菜时期[花序分生组织（FP）]；这些基因的变化于花原基发育有关。

右：青花菜发育停滞时期的基因表达[花芽期（FB）]与中间期[花原基（FP）]；这些的表达与花芽的膨大相关。

3.2 实验2：在同一发育时期不同温度下基因的表达分析温度是否会产生不同的发育时期继而造成基因表达的不同，我们做了2个实验。

第一，研究了花椰菜‘HRI 5295’的基因表达。

所有被研究的基因的表达都变化不显著（图4）。

只有BoAP1-a有显著变化，在22℃ /17 ℃与 22℃ /17 ℃处理之间上调2.4倍（图4A）。

第二，“蜜绿F1”在花球形成后的24小时后进行三种不同温度的处理，发育停滞在花原基-花芽期。

基因表达虽然变化不显著，但是BoAP1-a28℃ /22 ℃与 22℃ /17 ℃的总表达量上升了4倍。

图3.蜜绿F1的三突变体bocal 、boap1-a 、boap1-c花芽分开。

（A）分开前完整的花芽有四片萼片。

（B）花芽分成四片花瓣，六个雄蕊，和一个雌蕊。

3.3 实验三：BoAP1 和 BoCA L对BoFUL 和 BoTFL1表达的影响这一实验是为了研究BoFUL的积累会补偿BoAP1 和 BoCAL的缺失或者这些基因的表达都是独立的。

研究还发现当BoCAL突变时BoTFL1的表达量更高，所以预测CAL是限制TFL1的初始调控因子。

BoCAL的基因型没有影响BoFUL的四个同源类似物的表达（图6）.这些基因型也与BoCAL独立。

而与之相反的BoAP1与BoFUL-b, BoFUL-c, 和 BoFUL-d的表达上调紧密相关。

BoTFL1转录的丰富与BoCAL无关（图7）。

两个表达量最大的BoTFL1,L475 (CCAA), 和L17 (ccAA),在花原基时期发育停滞，而其他两系在花芽期停滞。

图 4.花椰菜在三种不同温度处理下基因的相对表达。