大规模测序1.RNA测序（RNA Sequencing）—高速序列比对2.转录组测序（Transcriptome sequencing）3.宏基因组测序1.转录组是指某个物种的特定组织或细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。

高通量转录组测序可以获得大量转录本序列信息，定量基因转录表达水平，获得基因组转录区域及其位点信息等，在基因组序列拼接注释、样品间基因转录差异表达（差异表达分析为考点）及其功能研究等方面有重要作用。

1. 有参考基因组的转录组分析技术路线推荐平台：Illumina HiSeq 2000、Illumina MiSeq 2. 无参考基因组的转录组分析推荐平台： Roche 454 FLX+二、生物信息学分析1) 有参考基因组的转录组1. 原始数据整理、过滤及质量评估2. 转录组测序分析与参考基因组比对蛋白编码基因的表达量分析蛋白编码基因的表达量差异分析差异表达的蛋白编码基因的聚类分析（热图）差异表达基因富集分析（GO、KEGG）SNPs的分析（SNPs鉴定、同义/非同义突变、与已有SNPs数据库比对）可变剪切分析UTR区域鉴定新基因/新转录本分析3. 根据客户需求进行个性化分析2) 无参考基因组的转录组1. 原始数据整理、过滤及质量评估2. 转录组测序分析：序列拼装及拼装统计Unigene功能注释Unigene的功能聚类分析（KOG、GO）Unigene的代谢途径分析（KEGG pathway）Unigene的表达量分析Unigene的表达量差异分析差异表达的Unigene的聚类分析（热图）差异表达的Unigene的富集分析（KOG、GO、KEGG）SNPs的鉴定3. 根据客户需求进行个性化分析四、经典案例案例1：人前列腺癌融合基因鉴定背景：人前列腺癌发病率位于男性恶性肿瘤的首位，并且发病率近年呈上升趋势。

目的：对人前列腺癌及癌旁组织基因转录组进行检测分析。

了解人前列腺癌的种族特异性及其可能的分子生物学机制。

结果：人前列腺癌的融合基因具有种群特异性，在欧美人群中普遍高频表达（50-80%）的融合基因TMPRSS2-ERG在中国人群中的表达率仅有20%左右，而在欧美人群中尚未发现的融合基因CTAGE5-KHDRBS3和USP9Y-TTTY15在中国人群中却有很高的表达频率，分别为37%和35.2%。

案例2：玉米不同发育阶段转录组研究背景：在单子叶植物中，分生组织分化产生叶片和叶鞘。

玉米叶片发育的整个顺序都是沿着长度分布的，不同的部位也呈现出不同的发育阶段。

目的：对玉米叶片转录组进行分析，了解基因结构和表达差异。

结果：定位了超过120 Mb条序列，定量叶片各发育阶段中成熟维管束鞘和叶肉细胞中的转录本丰度，发现在发育各个阶段的维管束鞘和叶肉细胞中分别有64%和21%的基因差异表达。

同时发现一个动态转录组，其中叶基部初级细胞壁和基本细胞代谢的转录本向顶端次级细胞壁生物合成和C4光合作用的转录本转变。

案例3：西葫芦（基因组未知）转录组研究背景：西葫芦属于葫芦科，富含维生素等营养成分，是一种重要的蔬菜。

然而与其相关的研究报道较少，限制了分子育种的发展。

目的：采用Roche 454 FLX对西葫芦的根、叶、花等组织进行转录组测序，分析SSR和SNPs位点。

结果：通过从头组装获得平均长度为626 bp的unigene 49,610条。

发现超过60%的unigene被注释分类到一个或者多个GO分类信息中。

在检出的SSR中共有1,882种基序类型和9,043个SNPs位点。

大量的分子标记，为遗传性状和数量性状位点分析发挥了重要的作用。

五、常见问题解答1. Q：转录组测序与基因表达芯片相比有哪些优势？A：与基因表达芯片相比，转录组测序具有如下优势：首先，应用范围广。

转录组测序无需预先设计探针或了解物种的基因组信息，同样适用于基因组序列未知物种；第二，准确性高。

基因芯片原理是基于核酸单链间的互补杂交，当杂交条件不同时，或者丢失低拷贝转录本信息，或者假阳性率高。

而转录组测序是基于对转录本序列的测定，准确性很高，而且当测序深度足够时，能够检测到极低低丰度表达的转录本信息。

第三，信息丰富。

转录组测序除了可以用于基因组注释和基因转录表达分析，而且能发现新基因，检测可变剪切，SNPs，融合基因等。

因此，转录组测序在诸多方面优于基因表达芯片，已经成为基因注释、表达检测和发现新基因等方面的主流技术。

2. Q：如何进行原核生物转录组分析？A：针对原核生物的mRNA没有poly A尾巴的情况，需要提供去除rRNA 后经过纯化的原核生物mRNA或cDNA样品。

3. Q：转录组测序需要多少测序量？A：转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。

而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。

因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。

①针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；②针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。

4. Q：转录组测序和数字表达谱测序有什么区别？A：转录组测序和数字表达谱测序相比，主要有如下不同：第一，测序目标不同。

转录组测序可以测定特定组织中全部mRNA，而表达谱测序只是测定mRNA的酶切标签序列（21 bp）；第二，代表性不同。

数字表达谱测序只测定21bp序列，而转录组测序测定转录本全长，因而可以更准确地代表样品转录表达情况；第三，应用范围不同。

转录组测序应用范围广泛，不仅可以检测表达量差异，而且可以发现新的转录本和可变剪切等。

而表达谱测序只能粗略检测表达量差异，不能反映基因转录表达的特点和规律；第四，参考序列要求不同。

转录组测序不仅可以适用于基因组序列已知的物种，而且也适用于基因组序列未知的物种。

而表达谱测序只适用于基因组序列已知的物种。

因此，对于想要检测表达量差异的客户，我们推荐进行转录组测序，以获知更精确的转录组信息。

3.宏基因组测序（Metagenome sequencing）宏基因组学（Metagenomics）也称为元基因组学，是以样品中的微生物群落作为整体进行研究的学科。

自然界中约有99%的微生物是不能在实验室条件下进行纯化培养的。

宏基因组学研究不要求对每个微生物进行分离纯化培养，而是直接从样品中提取基因组DNA后进行测序分析。

通过宏基因组测序，能够解释微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系，极大地扩展了微生物学研究范围。

目前宏基因组测序可以分为环境微生物多样性检测和宏基因组de novo测序。

其中环境微生物多样性检测是指通过对环境中微生物16S rDNA高变区/ITS 的PCR扩增产物进行高通量测序，分析该环境下微生物群落的多样性和分布规律。

宏基因组de novo测序是指对环境样品中所有微生物基因组DNA片段化后进行高通量测序，然后进行序列组装和基因注释，获得部分不可纯培养微生物的基因组序列，分析该环境下所有微生物基因集信息。

环境微生物多样性检测（Environmental microbial diversity detection）一、技术路线推荐平台： Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq二、生物信息分析1. 原始数据整理、过滤及质量评估2. OTU列表生成及注释3. 基于物种丰度分析：稀释曲线Alpha多样性分析物种丰度差异分析聚类分析（热图）多元统计分析（根据实验设计）4. 基于群落结构分析：单样品物种分布多样品物种分布含进化关系的物种分布Beta多样性分析（PCoA、NMDS）5. 根据客户需求进行个性化分析案例1：人类“肠型”研究背景：人体肠道微生物与人类健康息息相关，是否能以这些微生物的多样性来划分不同的肠型是一个值得探讨的问题。

目的：利用Illumina和Roche 454测序平台对不同年龄、体重、性别及国籍的人群肠道微生物多样性进行研究。

结果：研究发现人体胃肠道微生物区系并不是随机组合而成的，在所有受检人群中大致可以分为三种类型（enterotypes）：拟杆菌型（Bacteroides）、普氏菌型（Prevotella）、瘤胃球菌型（Ruminococcus）。

对更大规模的人群（154名美国人和85名丹麦人）进行调查也得到了同样的结论，这说明在人体的肠道内真正存活较好的微生物生态组，其数量可能并不太多。

不过这种分型方法和人体的年龄、体重、性别或国籍都没有任何关联。

案例2：北极多年海冰和表层海水微生物多样性研究背景：北极多年海冰（multiyear ice，MYI）的急剧减少表明这种环境可能在100年后就会消失，为了了解这种微生物多样性丧失的影响，对北极附近的两处多年海冰的微生物群落进行研究。

目的：利用Roche 454 FLX测序平台对2个多年海冰和3个海水样本中的微生物16S rDNA的V3区进行测序，揭示出北极多年海冰和表层海水的微生物群落结构。

结果：北极多年海冰与周围的海水中微生物存在很大的差异。

其中，多年海冰中的微生物群落多样性与海水相当，但是丰度较少。

此外，还首次在北极海冰中发现蓝藻以及一些过去未曾报道的低丰度微生物物种。

五、常见问题解答1. Q：哪些环境样品可以进行微生物多样性检测？A：针对宿主相关样品如皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等进行研究；针对环境相关样品，如土壤、水体、空气、盐湖、沼泽等进行研究。

2. Q：基于高通量测序的环境微生物多样性检测技术有何优势？A：常规的宏基因组学研究方法包括基因克隆文库、变性梯度凝胶电泳DGGE/TGGE等，但这些方法的通病是信息量太小，不能充分反映复杂的环境微生物多样性和分布。

基因克隆文库构建和检测的工作量大，且自然界中99%的微生物在实验室都没有办法纯化培养，从培养基上挑取克隆菌株，摇菌转化测序，效率低下。

DGGE法曾经广泛应用于检测微生物群落结构的多态性，但是需要标准菌株，且受到凝胶电泳特性的局限，无法检测到稀有菌群的种类，因此其重复性和分辨率都不甚理想。

第二代高通量测序无需构建质粒克隆文库，这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差，可以直接对环境样品中的基因组片段进行测序，简化了基本操作，提高了测序效率，它能够对一个群落中微生物的多样性作更加深入和全面的描述，且具有通量高，重复性好，精确度高的优点，因而在微生物生态学研究中逐渐占据了优势。

3. Q：人体为什么又叫“超级生物体”？A：1958年的诺贝尔生理及医学奖得主Joshua Lederberg提出了“超级生物体”（Superorganism）”的概念，是指人体由真核细胞与体内共生的微生物共同组成。