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四 三代测序技术的比较
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五 第三代测序技术的应用
基因组测序 甲基化研究 突变鉴定（SNP检测）
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基因组测序
由于具有读长长的特点，SMRT测序平台在基因组测序中 能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接 和注释的工作量，节省大量的时间[25]。Christophern等 [26]仅仅用0.5*的Pacbio RS系统长度的数据与38*的二代测 序(NGS)的测序数据，对马达加斯加的一种指猴基因组进 行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助 Pacbio RS的帮助将原有的Contig数量减少了10倍。 DavidA．等利用Pachio RS平台C2试剂通过全球合作几天内 就完成了从德国大肠杆菌疫情中获得的大肠杆菌样品以 及近似菌株的测序和数据分析，最终获得了2900bp的平 均读长以及99.998%的一致性准确度。在对霍乱病菌的研 究中，第三代测序技术已初现锋芒。研究人员对5株霍乱 菌株的基因组进行了测序研究，并与其他23株霍乱弧菌 的基因组进行对比。结果发现海地霍乱菌株与2002年和 2008年在孟加拉国分离得到的变异霍乱弧菌ElTorO1菌株 之间关系密切，而与1991年拉丁美洲霍乱分离株的关系 较远。相对NGS的优势就是能更快获得结果，因此该系统 在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很广泛 的应用
用于个性化医疗和遗传诊断等 临床服务
PacBio：美国太平洋生物科学公司 Helicos生命科学公司 Oxford ：牛津纳米孔公司
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二 第三代测序技术原理
第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第 一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美 国螺旋生物(Helicos)的TSMS技术和美国太平洋生 物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。
3、它的精度非常高，达到99.9999%。 4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，
那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA 的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。 5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合 酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基 化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不 同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
各有不同，在通量、读长、准 确度、速度和成本方面各具优 势，均在基因组de novo，重测 序、转录组、表观遗传学研究 中发挥了重要作用，并逐渐应
做出了许多重要的努力。这些新技 术包括Helicos的tSMS，PacBio的 SMRT，Oxford的Nanopore以及其它 一些尚处于实验室阶段的技术，如 电镜测序，蛋白质晶体管测序等等。
第三代测序
自从2006年第一台454 GS FLX 测序平台上市以来，基于非
◦ 另一类非Sanger原理的DNA测序技 术在2008年成为现实，这类基于单
Sanger测序原理的第二代高通 量测序 (next-generation sequencing, NGS) 技术迅速成为 了基因组学研究的重要工具， 其中包括Illumina Solexa、ABI SOLiD、Roche 454以及Life Tech 的半导体测序仪Ion Torrent PGM & Proton。这些平台原理
第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不 需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测 序
13级生物工程
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一 第三代测序技术的出现 二 第三代测序技术原理 三 第三代测序技术特点 四 三代测序技术的比较 五 第三代测序技术的应用
附：六 第四代测序技术
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一 第三代测序技术的出现
第二代测序
第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国 牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单
个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。
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TSMS技术
Helicos Bioscience (MA, USA) 于2008年推出的HeliScope单分子测序平台被认为是第一个商品 化的第三代测序仪。其测序原理tSMS是由斯坦福大学的S. R. Quake等科学家提出的。 tSMS是一种利用光学信号进行DNA碱基识别的边合成边测序 (sequencing by synthesis, SBS) 技术，与二代测序中的Illumina Solexa测序有类似之处，但该技误。
个分子信号检测的DNA测序被称为 单分子测序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS)。 据预测，SMS将比NGS具有更快的 速度和更低的成本，从而使研究人 员能够实现目前无法进行的研究工 作。尽管从现在的进展来看，SMS 还未能完全实现预期目标，但已经
T技术测序流程
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纳米孔单分子技术
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三 第三代测序技术特点
1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以 测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。
2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就 可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱 基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。
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甲基化研究
SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进 行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基， 都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时， 聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻 的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的 比值如果大于1，由此就可以推断这个位置有修 饰。甲基化研究中关于5 mC和5 hmC（5 mC的羟基化形式）是甲基化研究中的热点。但 现有的测序方法无法区分5 mC和5 hmC。美 国芝加哥大学利用SMRT测序技术和5 hmC的选 择性化学标记方法来高通量检测5 hmC。通过 聚合酶动力学提供的信息，可直接检测到DNA甲 基化，包括N6 甲基腺嘌呤、5 mC和5 hmC， 为表观遗传学研究打开了一条通路。