牙髓间充质干细胞生产
I．目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。

II．范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。

III．职责：
1.生产主管负责本制度的执行和监督；
2.技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作；
3.监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。

附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录
附表2 生产试剂耗材记录表
IV．规程：
一、牙髓间充质干细胞原代操作
消化法：
1.仪器耗材
1）10ml移液管
2）培养皿
3）50ml离心管
4）100μm筛网
5）T75培养瓶
6）15ml离心管
2.试剂
1）生理盐水
2）培养基
3）胶原酶
3. 酶消化法操作流程
3.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；
3.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，
持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；
3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml 0.2%胶原酶；
3.4 置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min ；
3.5 用100μm滤网过滤；
3.6 1200 rpm离心10min ，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；附表3 样本取样单
3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO
2培养箱中进行培养。

4. 组织块法操作流程：
4.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；
4.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；
4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底；
4.6 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养；
4.7 12-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。

二、牙髓间充质干细胞换液
1.耗材
1）10ml移液管
2）15ml离心管
2.试剂
培养基
3. 操作流程
3.1 镜下观察状态细胞；
3.2 吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；
3.3 吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的
培养基；
孵箱中培养。

3.4 观察细胞并将其置于37℃，5%CO
2
三、牙髓间充质干细胞传代培养
1. 耗材
1）10ml移液管
2）50ml离心管
3）培养瓶
4）15ml离心管
2. 试剂
1）生理盐水
2）胰酶
3）血清
4）培养基
3. 操作流程
3.1 显微镜观察，观察培养瓶中的细胞密度到达80%—90%，可进行传代培养；
3.2吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤贴壁细胞；
3.3 吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；
3.4 倒出剩余洗涤液（生理盐水），再加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；
3.5将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，6min，弃上清，重悬，加入培养基，然后按照1:2或1:3进行传代。

四、牙髓间充质干细胞成品制备
1. 耗材
1）10ml移液管
2）50ml离心管
3）15ml离心管
4）西林瓶/输血袋
2. 试剂
1）生理盐水
2）胰酶
3）血清
4）干细胞保存液
3. 操作流程
3.1 待细胞扩增总数达所需细胞数量后，吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤一遍；
3.2 加入10ml生理盐水+0.05%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；
3.3 将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，10min；
3.4 弃上清，细胞沉淀用30ml生理盐水洗涤二次，1200rpm，室温离心10min。

3.5 取第二次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写《样本取样单》；
3.6用干细胞保存液/生理盐水重悬细胞，转入专用的无菌西林瓶/生理盐水中，封口，贴标签，放置4℃保存。

3.7 完成初包装后，操作员立即将成品送交包装部门。

五、牙髓间充质干细胞的冻存
1. 耗材
1）10ml移液管
2）50ml离心管
3）15ml离心管
4）冻存管
2. 试剂
1）生理盐水
2）胰酶
3）血清
4）冻存液
3. 操作流程
3.1 将制备好的MSC于1200rpm室温，离心10min。

3.2 弃去上清，将细胞悬浮于适量冻存液中，使细胞浓度在107个细胞/毫升，
置于低温无菌冻存管中。

3.3 将细胞交给库管员经过程控降温后于液氮中冷冻保存，并填写《冻存样品交接单》。

附表4 冻存样品交接单
六、牙髓干细胞的复苏
1. 耗材
1）10ml移液管
2）50ml离心管
3）15ml离心管
4）培养瓶
2. 试剂
1）生理盐水
2）培养液
3. 操作流程
3.1 将液氮中的细胞取出于37℃水浴中迅速融化；
3.2 将细胞置于装有10~15倍ml生理盐水无菌离心管中，1200rpm离心10min；
3.3 弃上清，加入30ml生理盐水洗涤细胞两次；
3.4 取第一次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写《样本取样单》；
3.5 弃上清，重悬细胞，在细胞悬液中加入培养液，吹匀；
3.6 将单细胞悬液种植于细胞培养瓶，继续培养。

备注：
1.每次进行操作前，需将万级车间和百级实验台照射紫外线30min，风机开启后10-15min后方可进入实验场所进行操作；
2.进入GMP车间后，实验人员先进入物品存放间取已经表面消毒过的垃圾桶、废液缸、实验耗材等进入相应操作间，并从配液间取出相关使用试剂放于实验操作台；
3.细胞的取出与放回：开启培养箱前，需75%擦拭手掌后方可取放细胞；
4.操作细胞过程，手臂尽量在实验台进行操作，不要将手臂反复拿出实验台，如拿出手臂再进入需重新喷洒酒精，方可进入；
5.镜下观察，看是否有杂菌的感染，若有杂菌感染，立即封口后进行清理，不做留用。

6.清场：擦拭操作台，用酒精棉球擦拭每一个有操作接触到过的地方；将废液缸和垃圾桶喷洒75%酒精后放置于污物出口；实验台内未用完的耗材需全部放置于不锈钢推车上，台内不留任何实验耗材；所有试剂归放配液间冰箱。

7.生产各部分均应填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》；
8.细胞培养结束以后，监督员需将《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》及时交给总检人员，确认材料齐备无误后，由总检人员负责提档案员整理归档。

《样本取样单》为质检部门内部保管。