凝集试验
• 颗粒性抗原与相应抗体结合后发生凝集的 血清学试验。 • 抗原与抗体复合物在电解质作用下，经过 一定时间，形成肉眼可见的凝集团块。 • 试验可在玻板上进行，称为玻板凝集试验， 可用于细菌的鉴定和抗体的定性检测； • 亦可在试管中进行，称试管凝集试验，主 要用于抗血清效价测定。
实验原理
流感病毒结构模式图
血凝素（HA） 柱状
刺突：亚型特异性抗原，易变异
血凝素（HA，从H1—H15):呈柱状 功能： ①吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒 侵入细胞 ②凝集多种动物的红细胞（血凝试验） ③具抗原性：其抗体能中和病毒---中和抗体 抑制血凝（血凝抑制试验）
血凝试验原理
• 血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因 编码的糖蛋白刺突。 • 与病毒吸附和传入宿主细胞有关。 • HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－ 乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。 • 为病毒的 红细胞凝集反应或血凝反应。
结果判定
1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱 缩。 “3＋” 红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。 “2＋” 红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。 “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。 “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。 2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的 终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集 价。
实验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排 1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加 25ul生理盐水 2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第 2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
++++
弃
x 25血 凝素 25 25
++++ 11(+)
H A
25 25 25 25
-
25 25 25 25
-
25 x 25 25
_ 12（-)
孔号
稀释度 生理盐 待检血 清
4HA血凝 素
1%鸡红 细胞 结果预测
1
2 25 25
2 3
4 25 25 8 25 25
4
16 25 25
5
32 25 25
6
64 25 25
7
128 25 25
8
256 25 25
9
、、
10
、、
HI
弃 X 25 25 x
25 25
25 25
25
25
-
25
25
-
25
25
-
25
25
-
25
25
-
25
25 ++
25
25 +++
25
25 +++
25
25 +++
25
25 +++
25
25 -
25
25 ++++
凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍 数为病毒的凝集价。 能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒 液0.25ul为一个病毒凝集单位。 凡能使4个凝集单位的病毒凝集红细胞的作用 完全受到抑制的血清最高稀释倍数，称为血 凝抑制价
血凝原理
血凝抑制原理
血凝抑制试验原理

病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所 抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸附于 红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝 集的现象，称为血凝抑制．
实验材料
器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头
试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生 理盐水
• 3.在1-12孔内均加入“四价”血凝素25ul，震荡 后，室温静止作用5min。 • 4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震 荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。
• 5.观测结果，记录实验数据．
血凝抑制试验结果判定
• 测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+) 凝集 （-） • 病毒对照孔：凝集 • RBC对照孔：无自凝 • 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血 清稀释度。
血凝抑制
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-
10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul 生理盐水。 2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入 第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至 第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。
• 思考题 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反 应？为什么？ 2、血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应? 为什么？ 3、血凝试验中为什么要加补充液？ 4、为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？ 5、血凝试验和血凝抑制试验中空白对照的意义？
孔号
稀释度
生理盐 血凝素
生理盐水 1%鸡红 细胞 结果预测
• 3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。 • 4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡， 室温静止感作15-30min，每5min观察一次结果。 • 5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用．
血凝试验结果判定
• 效价判定： 凝集特别显著：“＋＋＋＋” 凝集现象次之：“＋＋＋” 凝集清楚可见：“＋＋” 稍显凝集者：“＋” • 血凝效价：呈“＋＋”凝集时的最高稀释 度。此时的稀释度即为1个血凝单位。
1
2
25 25 25 25
++++
2 3
4
25 25 25 25
++++
4
16
25 25 25 25
++++
5
32
25 25 25 25
++++
6
64
25 25 25 25
+++
7
128
25 25 25 25
++
8
256
25 25 25 25
+
9
、、
10
、、
11(+)
12（-)
8
25 25 25 25
实验二 血凝及血凝抑制实验
实验目的
１血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)， 采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。 ２血凝抑制试验： 应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特 异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒． ３检测实验用鸡群有无病毒感染和监测鸡的免疫状 态。 ４ 掌握基本操作技术,了解其实用价值 ．