次或24h后，观察动物所产生的警醒毒性反应及其严
重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计
算半数致死量（LD50）。据此分析受试动物毒性反应 与剂量的关系，并根据LD50值对药物进行毒性分级。
三.实验材料
（1）器材
（2）药品
1ml注射器、电子天平、记号笔、镊子、剪刀等。
盐酸赛拉嗪注射液。
（3）动物
实验一
急性毒性试验
•
（一） 药物LD50的测定
一、实验目的
（1）理念——是药三分毒;
（2）了解一些常规药物毒理学的试验方法， 及评价指标; （3）掌握药物急性毒性试验的试验设计方 法、LD50的测定及计算方法。
二. 实验原理
选择健康的实验动物，根据体重按随机分组方法，
根据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一
死试验。
（2） 致癌实验： 短期致癌实验和长期致癌实验。
（3） 致畸胎试验：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期给药，观察对子代的影响。
最大耐受剂量(MTD)
指在外来化合物急性毒性实验中,化学物质不引起
受试对象(实验动物)出现死亡的最高剂量,故可缩写为LD0。一般不用最大耐 受剂量来比较两种外来化合物的毒性。 治疗指数 为药物的安全性指标。通常将半数中毒量（TD50）/半数有
察受试区皮肤的变化，有无红斑、水肿等现象。
如为多次给受试物实验则一般每日涂抹一次，连续一周， 其余均与一次给受试物的方法和要求一致。
2、结果判断与评价
每只动物实验结果按表1进行刺激反应评分，
计算出平均分值按表2进行刺激强度评价：
表1 皮肤刺激反应评分
红斑形成
无红斑 勉强可见 明显红斑 中等-严重红斑
急性毒性试验
是指一次或24小时内多次染毒的试验，是毒性研究的
第一步。要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。通常为小鼠或大鼠采用经 口、吸入或经皮染毒途径。急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度）， 观察急性中毒表现， 亚慢性毒性 是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出
现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。“多日”的确 切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学 中所要求的连续接触为3～6个月，而在工业毒理学中认为1～3月即可。
分值计算方法
角膜评分：分值×５
虹膜评分：分值×５
结膜评分：（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）分值×２
总分：３项评分之和。 分值范围（０－５０分）
眼刺激性评价标准
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 刺激程度 积 分 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 无刺激性 ０－ 5 轻度刺激性 ５－１５ 轻度刺至中度刺激性 １５－２０ 中度刺激性 ２０－３０ 中度至重度度刺激性 ３０－４０ 重度刺激性 ４０－５０ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
Σp：各组动物死亡率之总和 。
5. 评价指标
急性毒性分级 小鼠一次经口LD50 大致相当于体重 70kg人的致死剂量
极毒
剧毒 高毒
<1 mg/kg
1mg --10 mg/kg 11--100 mg/kg
< 7滴
7滴 ~ 1茶匙 1茶匙 ~ 35克
中等毒 低毒
无毒
101 - -1000 mg/kg 1001--10000 mg/kg
眼睛部分结构：模式图
眼刺激试验--角膜评分
刺激反应强度
无混浊 极轻微弥漫性混浊，虹膜清晰可见 轻度混浊（虹膜细微结构不清晰） 混浊（虹膜结构不清，瞳孔大小看不到） 极混浊（虹膜完全看不到）
评分
0 1 2 3 4
眼刺激试验—虹膜评分
刺激反应强度 评分
正常
皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围
0
1
轻度充血，瞳孔对光仍有反应
出血，肉眼可见坏死，对光无反应（或源自出现其中一种反应） 2眼刺激试验—结膜评分
Ａ. 充血（指睑结膜、球结膜部位） 血管正常 血管充血呈鲜红色 血管充血呈深红色，血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 Ｂ. 水肿 无水肿 轻微水肿（包括瞬膜） 明显水肿，伴有部分眼睑外翻 水肿至眼睑近半闭合 水肿至眼睑超半闭合 Ｃ. 分泌物 无分泌物 少量分泌物 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 评分 ０ １ ２ ３ ０ １ ２ ３ ４ ０ １ ２ ３
构,是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进 入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色 单体或染色体的无着丝粒片断或环。最后单独形成 一个或几个规则的次核，存在于细胞质中，由于比 核小得多故称微核。 微核的产生与染色体损伤有关。
以受试物处理啮齿类动物，然后处死，取骨髓，制片、固定、
染色，于显微镜下计数PCE中的微核。如果与对照组比较，处 理组PCE微核率有统计学意义的增加，并有剂量-反应关系， 则可认为该受试物是哺乳动物体细胞的致突变物。
微 核（micronucleus, 简称MCN）
也叫卫星核,是真核类生物细胞中的一种异常结
>10000 mg/kg
35 ~ 350克 350 ~ 1050克
>1050克
6. 注意事项
6.1 正确捉拿小白鼠，防止咬伤；
6.2
注意肌肉注射方法，给药剂量力求准确；
6.3 实时注意观察小鼠中毒症状及其发生时间、死亡 时间。
7. 作业
7.1 查阅文献，与国内外相关文献报道结果作比较。
7.2 撰写试验报告
健康成年小白鼠若干只，体重18-22g。
四.实验方法
1. 预实验
各组剂量分别为Dmax、（ Dmax ）r、（ Dmax ）r2、(Dmax)r3……….
2.正式试验
2.1试验步骤 小白鼠禁 食6-10h 60min
随机分成5组
各组按试验设 计方案给药 计算LD50
记录小鼠死亡 只数
得出结论
将小白鼠随机分成5组，每 组4只(随机单位 组设计方法)。
三、实验材料
1、动物：成年健康家兔。家兔休重2kg左右，与给受试物24
小时将动物背部脊柱两侧毛脱掉，脱毛面积约为体表面积1０
％（家兔每侧各约50cm2）。 2、受试物：膏剂、液体或粉末。粉末需用适宜赋形剂（如 羊毛脂、凡士林等）混匀，本实验采用10%双氧水溶液。
四、实验方法
1、实验操作：在家兔背部受试物区和对照区（脱毛后），一 次将受试物1ml均匀涂布受试物区，将生理盐水涂布于空白对 照区，再以医用纱布及胶布进行包扎固定，开始计时。在给 药后30分钟取下包扎，用温水洗净皮肤上的残留受试物，观
（二） 刺激性试验
1. 皮肤刺激实验
2. 眼部刺激实验
1.皮肤刺激性实验
一.实验目的
通过比较染毒动物与正常动物皮肤的变化，学
习评价外源性化学物急性皮肤刺激的 基本方法。
二、实验原理
皮肤刺激试验是指皮肤接触药物是否产生可逆性炎性症状的 试验，它又分急性皮肤刺激试验（一次皮肤涂抹实验）和多次皮 肤刺激试验。
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4. 计算LD50
4.1计算方法：目测机率单位法、加权机率单 位法(Bliss 法)、寇氏法、序贯法。 4.2 Bliss 法是目前推荐使用的方法。此法对 剂量分组无严格要求，不需要剂量组有0%和 100%死亡率，是目前公认最准确的测定方法。 4.3 我国卫生部规定，Bliss法是作为新药 LD50测定评定必须采用的方法。
（1）小白鼠编号（从1-20号）用两种颜色记 号笔进行标记： 黑色代表个位（蓝色记号笔）； 红色代表十位（红色记号笔）。 （2）小鼠称重并按体重大小依次排序。 ① ④ ② ⑤ ③ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨
2.2 试验设计
组别 1 2 3 4 5
小鼠编号 5 18 20 7 13 6 9 1 19 15 2 12 3 16 17 11 10 8 4 14
积分
0 1 2 3
紫红色红斑并有焦痂形成
4
0
水肿形成
无水肿
勉强可见
皮肤隆起轮廓清楚 水肿隆起约1mm 水肿隆起超过1mm，范围扩大 总分
1
2 3 4 8
表2 皮肤刺激强度评价
刺激反应 无刺激 轻度刺激 中度刺激 强刺激 分值 0-0.4 0.5-2.9 3-5.9 6.0-8.0
2. 眼刺激试验
一.试验目的 1.眼刺激试验目的； 2.眼刺激试验方法； 3.眼刺激试验结果的评价方法。
二、实验材料
1.动物：家兔；
2.受试物：10%双氧水溶液；
3.剂量：滴入1滴； 4. 方法：滴入一侧眼结膜囊内，另一侧作为空白对照（滴 入等量生理盐水）。给药后使眼睛被动闭合 1min 。记录给 药后5min、10min、15min、20min时眼的局部反应情况（1h、 12h、24h、48h、72h）。
效量（ED50)或半数致死量（LD50）/半数有效量（ED50）称为治疗指数。
治疗指数大的药物相对治疗指数小的药物安全，但以治疗指数来评价药物的 安全性，并不完全可靠。
安全范围
是指药物的最小有效量与最小中毒量之间的范围，它表示药
物的安全性，一般安全范围越大，用药越安全。药理学用上95%有效剂量 （ED95）到5%中毒剂量（LD5）的距离来表示。
计算方法1：加权机率单位法(Bliss 法)-软件辅助计算
计算方法2： 2. 改良寇氏法公式计算： LD50=log-1[Xm-i(Σp-0.5)] Xm：为最大剂量组剂量对数值； i：为相邻两组剂量比值的对数（相邻两组对数剂量的差值， log2）； P：为各组动物死亡率（用小数表示，如果死亡率为20%应写成 0.20）；
药物毒理学实验
指导老师： 刘 娟 罗艺晨
• 毒性试验
•
给实验动物进行不同途径、不同期限的染毒、检测各
种毒性终点的实验。其目的是确定无害作用水平、毒性类