关于新病毒鉴定的研究进展The progress in the research about the identification of novel virus【摘要】：随着新型病毒不断被发现，新病毒的鉴定对于治疗、预防和控制病毒感染起着重要的作用。

本综述首先从形态学的角度阐述如何鉴定新病毒，包括了病毒的分离和培养，以及电子显微镜观察。

但仅仅形态学上的鉴定是不足够的，需要结合分子生物学的手段。

目前最常用分子生物学的手段是构建系统进化树，这不仅可以了解病毒的核酸和氨基酸序列，而且可以阐明病毒的起源及其变异。

【关键词】：新病毒，鉴定，形态学，分子生物学Abstract: Along with continuous discovery of novel virus, how to efficiently identify them plays an essential role in the treatment, prevention and control of virus infection. Firstly, this review will describe how to identify novel virus morphologically, includingthe isolation and culture of virus as well as observation throughtransmission electron microscopy. However, evidence from morphology is not enough for virus identification. Therefore, it is necessary to combine it with molecular biological means. So far, Phylogenetic trees has become the most popular molecular biological way used to virus identification, which can illustrate the sequence of nucleic acid and amino acid as well as the origin and gene variation of virus.Key word: novel virus, identification, morphology, molecular biology近年来，随着人类活动范围的增大以及交流的增多，陆续出现人类感染新型病毒的情况，由于人类对新型病毒缺乏免疫力，其感染会对人类健康造成很大的威胁，严重者甚至威胁患者生命。

因此，快速准确鉴定新型病毒不仅有利于临床上确定有效的治疗方法，更有助于公共卫生机构采取有效措施切断传播途径，降低其对人群的威胁。

本综述将从形态学和分子生物学这两个方面展开论述，讨论关于新病毒鉴定的研究进展。

1.形态学首先我们要明确新型病毒的感染病例，病毒感染常见的症状是发热，中性粒细胞减少，淋巴细胞升高，病情严重者会出现高热，严重的身体不适，恶心，呕吐，腹泻，明显的出血倾向，白细胞减少，严重的血小板减少，凝血功能异常等[1, 2]。

但由于感染的症状不具有特异性，需要相应的辅助检查，当辅助检查无法确定病原体时，我们就要警惕是否是新型病毒感染，应马上开展以下措施来明确病原体。

1.1分离病毒首先收集患者标本，如血清，组织标本，鼻咽拭子，尿液，粪便，痰液等，然后按照相应的方法处理标本，标本采集后应立即冷冻保存并迅速送到实验室。

最后向标本加入1000μ/mL青霉素，1000μ/mL链霉素，2000r/min离心30min，取上清作病毒的分离培养[3]。

1.2病毒培养1.2.1鸡胚培养法鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的培养方法，此方法可用于多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。

病毒分离一般使用10天大小的无菌鸡胚[4]。

鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物容易，无饲养管理及隔离等特殊要求，而且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，鸡胚培养法是常用的一种培养动物病毒的方法。

1.2.2乳鼠接种法选择健康的3-5日龄乳鼠，在无菌条件下，用0.25ml 的微量注射器脑内接种,每份样品接种一窝(至少5只)，每只乳鼠脑内接种0.02ml，或同时腹腔接种0.03ml/只。

每日观察小鼠的发病情况, 一般观察7-14天。

观察期内若未出现乳鼠发病，将乳鼠解剖取脑、肺组织，研磨成10%的组织悬液，接种乳鼠，连续盲传3代[5]。

1.2.3细胞培养法将处理好的标本接种于长成单层细胞上，37℃吸附1h，然后吸出标本液，加含有2% 小牛血清的细胞维持液，置37℃CO2培养箱培养。

每天观察细胞变化，连续观察10天。

若不出现细胞圆缩，脱落等细胞病变现象，则进行盲传, 连续盲传3代，若连续盲传3代后无病变则弃去，重新培养[3, 5]。

常用的病毒培养细胞种类有：Vero, Vero E6,MDCK,Hela,Hep-2,HEL, DH82, L929,HP和蜱细胞系ISE6等。

病毒可在细胞上生长并使细胞出现明显病变,说明这些细胞是该病毒的允许性细胞，不能支持病毒增殖的是非允许性细胞[3]。

2003年中国爆发SARS（SevereAcuteRespiratorySyndromes,SARS）疫情，该病是由一种新型冠状病毒引起的，患者标本的SARS 冠状病毒分离均在P3级生物安全实验室中进行，该病毒的允许性细胞为V ero、RD、VeroE6、Hep-2细胞，待其长成单层后，接种患者病毒标本1 mL，每天观察细胞病变。

培养数天后，当细胞病变达+++~++++，收取细胞液，置-80℃保存[6]。

1.3电子显微镜观察电子显微镜，又称投射电镜，可明确病毒颗粒在细胞内的定位，病毒的形状，直径，胞膜的结构等。

1.3.1电镜负染色检查电镜负染色检查可以观察病毒颗粒，来确定其形态、直径以及其胞膜结构。

收集分离病毒感染的细胞培养液，以6.1%、pH7.2的戊二醛固定液与培养液按1: 1比例混合固定后，以3%磷钨酸溶液负染色，透射电镜观察[5]。

Yu XJ等利用电镜负染观察在中国新发现的本雅病毒[2]。

通过观察病毒的形态特征，可以对其种属进行推断，例如在电镜下观察到SARS 的病原体是冠状病毒，提示可以从冠状病毒着手开展对SARS病毒的研究。

1.3.2 超薄切片电镜观察超薄切片电镜观察可以了解病毒在细胞的定位以及感染细胞内细胞器的形态变化。

取感染细胞，用3.1%、pH7.2戊二醛固定，1/15mol/L，pH7.2磷酸盐等渗缓冲液洗涤3次，1%锇酸固定后，梯度乙醇脱水，Epon812包埋，常规超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察[5]。

祝庆余等利用超薄切片观察SARS冠状病毒，发现病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外，多聚集成堆。

感染细胞可见内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解，细胞核染色质凝聚，边集[5]。

潘欣等将SARS冠状病毒感染的Vero E6细胞行超薄切片电镜观察，亦在粗面内质网池和小泡中查见病毒颗粒，细胞外的颗粒则成群黏附在细胞膜表面，负染色电镜观察证实，病毒颗粒直径约80nm-140nm[7]。

2.分子生物学形态学上基本认为是病毒，然后进行分子生物学检测，进一步鉴定病毒，提取病毒的基因DNA或RNA，针对特定的基因片段设计随机引物，利用PCR扩增基因片段，进行基因的序列测序，拼接，分析。

常用的分子生物学方法有构建系统进化树。

2.1系统进化树系统进化树（英文:Phylogenetic tree）是表明具有共同祖先的各物种间演化关系的树，是一种亲缘分支分类方法。

在树中，每个节点代表其各分支的最近共同祖先，同时可通过给出分支层次或拓扑图形，反映物种之间的进化距离。

进化树可用来评价基因或蛋白在进化过程中的演变和亲缘关系，粗略估计不同类群生物之间的进化关系[8, 9]，分析基因组的易变区和保守区[10]，还可以确定插入片段，病毒是否发生基因重组，发现替代位点以及替代位点的重组。

另外，进化树可以更清楚地阐明病毒在人群间流行和跨宿主传播的基本规律，为预防、控制和预报病毒发生和流行提供新的理论支持[11]。

2.1.1病毒基因片段的提取分离培养病毒后，首先提取病毒的基因。

目前，很多生物公司都有病毒基因提取的试剂盒，利用试剂盒可以快速有效地提取病毒的基因。

2.1.2基因片段的扩增对于RNA病毒，提取病毒RNA，进行逆转录，得到cDNA，设计随机引物利用PCR 扩增cDNA。

而对于DNA病毒，提取病毒DNA，作为PCR模版，针对基因片段设计引物，制定扩增体系，扩增出特异的产物。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

然后利用相关的试剂盒提取跑胶产物。

接着对所有PCR产物进行DNA测序，得出病毒基因的编码信息。

同时也可将测序结果发送至美国国立生物信息中心和欧洲生物信息所的国际网站进行BLAST和ClustalW分析，进一步验证测序结果[8]。

2.1.3收集基因序列数据在获得新型病毒的序列后，还要收集同类型相关病毒的序列数据，以进行种系分析。

常用的基因数据库有GenBank，European Nucleotide Archive(ENA)。

从上述数据库中下载相关病毒的基因序列，张文彤等建议除了收集编码信息外，还应该收集其采集年代、采集地点、宿主类型等流行病学信息[11]。

张家敏等在鉴定新型冠状病毒时从GenBank下载了200多个SARS冠状病毒和SARS样冠状病毒全基因组，在构建系统进化树时，他们去除一些重复的、不完善的或基本一致的序列，分析病毒间的同源性[12]。

另外，邱国华等进行中国丙型肝炎病毒的进化树分析后发现片段测序分析与全基因序列分析可能在进化树分析结果上有一定差距，序列越长，所取序列数量越多，进化树分析误差越小，越能反映出真实的基因型[13]。

2.1.4基因片段的编辑基因片段的编辑需要软件来完成，常用的软件有DNAStar，Clustal。

使用上述软件进行如进行序列对齐，截取对应目的基因（特征基因）的部分进行编辑核酸序列工作。

2.1.5绘制和分析系统进化树基因片段编辑完成后，接着进行多序列比较，进而建立系统进化树[8]。

常用的软件有Clustal，DNAstar，Phylip，ARB，MrBayes，BAMBE，PAUP，TreeView，Phylowin，fastDNAml，SEMPHY，PALM等。

分析进化树的算法有①矩阵法②简约法③最大似然法④后验概率法。