嗅鞘细胞与雪旺氏细胞胞内蛋白的比较王晋，朱悦中国医科大学附属第一医院，沈阳（110001）E-mail：Kingwung@，zhuyuedr@摘要：【目的】利用蛋白质组学双向电泳的实验方法,比较嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells , OECs) 与雪旺氏细胞（Schwann’s cells,SC）胞内蛋白的差异.【方法】以原代培养的方法分离、培养、纯化成年大鼠嗅球OECs及SC。

分别提取两种细胞胞内蛋白,双向电泳分析蛋白差异点。

结果 (1)原代培养OECs 纯度可达90 %以上,SC的纯度可达95%以上。

(2) OECs和SC的胞内蛋白存在多个蛋白点的表达差异。

【结论】两种细胞都达到了一定的高纯度，OECs和SC胞内蛋白的差异比较明显，差异的蛋白点可能是决定了两种细胞在脊髓损伤时不同功用的关键。

关键词：嗅鞘细胞，雪旺氏细胞，双向电泳，胞内蛋白嗅神经系统在一生中都在进行嗅觉感受器神经元的神经再生[1]，嗅鞘细胞同时具有周围神经系统雪旺氏细胞和中枢神经系统星形胶质细胞的特性[2]，轴突横断后嗅上皮层新生的嗅觉感受器神经元增量增殖其轴突到中枢神经系统的嗅球小球层[3]，嗅鞘细胞能够包绕从嗅上皮层延伸到嗅球小球层的新生轴突成鞘。

它通过分泌各种促进神经轴突再生的物质提供允许轴突再生延长的微环境，使轴突较容易的进入中枢神经系统。

研究证明嗅感受神经元轴突的延长和向嗅球的靶向运动主要受嗅鞘细胞的支持[4]。

另外，一些报道提出嗅神经层内层的幼稚嗅鞘细胞在再生和发育的过程中可以改变他们的形状和增殖数量并且可以调控重排嗅感受神经到达嗅球[5] [6]。

同时它又有雪旺氏细胞所不具备的特点：嗅鞘细胞能够沿着宿主神经通路在胶质细胞的校直下移行的更远；嗅鞘细胞能够抑制轴突分支和游走，诱导轴突快速直线生长穿过损伤区域直达通路远端[7]。

大量的试验证明了嗅鞘细胞成功的促进体内[8] [9]，和体外[10] [11] [12]的轴突再生。

其中嗅鞘细胞能够分泌各种促进神经轴突再生延伸的物质提供有利的微环境在它促进轴突再生的能力中扮演一个重要的角色。

Boruch等的研究发现嗅鞘细胞的单克隆细胞系表达神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素（NT-4/5）和neu基因调节剂（neuregulins）的mRNA。

但是不表达NT-3和睫状神经营养因子（CNTF）的mRNA[13] [14]。

Woodhall等研究发现嗅鞘细胞表达NGF、 BDNF、GDNF和NTN的mRNA。

[15] Adam和Lipson等则对不同发育阶段的嗅鞘细胞表达的神经再生相关蛋白进行了研究，结果发现不同时期的嗅鞘细胞表达的情况也不相同[16]。

除了神经营养分子，研究还发现嗅鞘细胞可以分泌大量的诸如N-CAM和层粘连蛋白等细胞外基质分子[17] [18]。

N-CAM基因缺乏的小鼠嗅球显著的小于正常的小鼠[19]。

同时嗅鞘细胞还表达一些对轴突再生起抑制作用的蛋白，诸如GFAP、CSPGs、Nogo等[20] [21]。

另外, Au E等人发现了OEC中表达SPARC,可以促进SC的生长,并且能够促进脊髓损伤的修复[22] [23]。

OEC和SC中蛋白质的表达具有一定的差异，可能决定了良种细胞在脊髓损伤修复中的功能差异[24]。

对于嗅鞘细胞表达的神经营养因子及其他因子仍存在许多争议。

1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 使用的仪器动物手术器械一套、细胞培养常用仪器、高压消毒锅、深冻冰箱、显微解剖镜、电热恒温鼓风干燥箱、离心机、显微解剖器械一套、倒置显微镜、二氧化碳孵箱、水平单向流净化工作台、电热恒温水浴箱。

DMEM培养基、F-12培养基、胰酶、小牛血清，多聚左旋赖氨酸、P75,二维凝胶电泳设备、图像采集系统、图像分析软件及计算机设备。

1.1.2 主要试剂D-Hanks，Bovine Pituitary Extract（BPE），多聚左旋赖氨酸（Sigma），胎牛血清，DMEM （Gibco），mouse anti rat mAb P75、S100（Chemicon），胰酶（Invitrogen），蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 µl蛋白酶抑制剂混合液，5 µl PMSF和5 µl磷酸酶混合液），双向电泳相关试剂（详见下文）1.1.3 实验动物两月龄成年Wistar大鼠：中国医科大学动物部提供1.2 方法1.2.1 OECs和SC的分离、培养和纯化及两种细胞的鉴定①取18天大Wistar大鼠，麻醉，断头，取嗅球及双侧坐骨神经，解剖显微镜下分离所需细胞，胰酶消化，离心，用DF—10S培养所得细胞；②用改良Nash法纯化嗅神经鞘细胞,用Morrissey法纯化雪旺氏细胞；③P75抗体鉴定所得的嗅鞘细胞纯度；S100抗体鉴定所得的雪旺氏细胞纯度；1.2.2 OECs和SC胞内蛋白的提取从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。

预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。

配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂。

细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。

用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。

裂解液于预冷的离心机中14,000xg离心15分钟。

弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

1.2.3 双向电泳及图像分析第一向等电聚焦：从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。

在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。

从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。

从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。

加入样品用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。

在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序。

聚焦结束的胶条。

立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳：配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。

配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm 的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。

聚合30分钟。

一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。

待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。

配制胶条平衡缓冲液I。

聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。

将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。

将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。

将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

配制胶条平衡缓冲液II。

第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。

并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。

将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。

赶去缓冲液表面的气泡。

第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。

并用滤纸吸取多余的平衡液。

将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。

将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。

在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。

将凝胶转移至电泳槽中。

在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

进行染色。

考马斯良蓝染色：0.1%R250 +450ML 甲醇 +100ML 冰醋酸加双蒸水至终体积为1000ML 30min,脱色液：450ML 甲醇 +100ML 冰醋酸加双蒸水至终体积为1000ML 3×30Min。

2. 结果与讨论本实验采用改良Nash法纯化嗅神经鞘细胞,采用Morrissey法纯化雪旺氏细胞，原代培养嗅神经鞘细胞纯度可达90 %以上, 雪旺氏细胞的纯度可达95%以上。

通过对两种细胞的蛋白质进行双向电泳和图像分析，结果发现在嗅鞘细胞中有四个表达明显高于雪旺氏细胞的蛋白质，在雪旺氏细胞中存在两个表达高于嗅鞘细胞的蛋白质（图一所示）。

图1 嗅鞘细胞和雪旺氏细胞蛋白质双向电泳比较，▲箭头所示为差异表达的蛋白质。

目前对于嗅鞘细胞和雪旺氏细胞的蛋白及离子通道有很多相关的研究。

特别是由于嗅鞘细胞独特的中枢神经修复功能使得对嗅鞘细胞的研究较为丰富。

2.1 嗅鞘细胞分泌神经营养因子的种类促轴突再生延伸的两类物质：神经营养蛋白和粘附蛋白。

神经营养蛋白主要包括：神经生长因子基因家族(Nerve growth factor gene family)：NGF、BDNF、NT-3、4、5；成纤维细胞生长因子家族(Fibroblast growth factor family)：FGF-1~9；胶质细胞源性神经营养因子(Glial-derived neurotrophin factor)：GDNF-1、-2、Neurturin（NTN）等；转化生长因子家族(Transforming growth factor family)；生神经因子家族(Neuropoietic factor family)：CNTF等；表皮生长因子家族(Epidermal growth factor family)： ErbB等。

血小板源性生长因子家族（Platelet-derived growth factors）；胰岛素样生长因子；OEC中表达SPARC [12]。