米曲霉固态发酵生产中性蛋白酶1、实验目的及要求：通过固态三角瓶培养曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法：2、实验原理、过程和方法2.1原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。

在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。

固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。

部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。

固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。

固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。

其主要优点是节能，无废水污染。

单位体积的生产效率较高。

我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。

故染菌问题未得到根本解决。

本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。

菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。

2.2过程米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。

米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。

2.3方法米曲霉的培养本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。

三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。

试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。

每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。

或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。

三角瓶培养基制备：米曲霉的培养其1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；装料厚度：1cm左右；灭菌：120℃，30-60min；接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。

固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。

实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。

这点与液态发酵是不同的。

28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。

培养时间一般为48-70小时。

3、实验仪器、设备和材料恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。

米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）4、实验分析项目和方法米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；米曲霉蛋白酶活力的测定方法简介：（1）称取充分研细的成曲5g，加入100ml水，40℃水浴间断搅拌1hr，过滤，滤液用适当的缓冲液稀释一定的倍数。

（2）样品的测定：取试管3支，编号，每管加入样品稀释液1ml，40℃水浴中预热2分钟，再加入同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤。

然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加0.4mol/L的碳酸钠5ml,已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。

（3）计算：在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为一个酶活力单位。

样品蛋白酶活力单位（干基）=A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；4：4ml反应液取出1ml测定；n:稀释倍数；10:反应十分钟；W：样品水份含量（%）5、实验报告内容和数据处理两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。

6、实验结果和讨论实验时间：1周组织形式：每班分为6组，每组学生5人，做3×2个三角瓶。

每12小时取样一个，分析测定蛋白酶活性。

比较两种培养基的米曲霉培养物的蛋白酶的活性的高低。

附录1：固态转轴发酵设备的结构与工作原理重要说明：在第一次操作本设备之前请仔细阅读本操作说明书；设备必须可靠接地；湿度仪最高使用温度不大于80℃，防水浸；发酵开始前准备工作（设定为发酵条件，进行DO电极斜率标定、pH 电极零点标定）；发酵结束数据存盘；关闭总电源前，请将控制器返回主菜单，然后按Ctrl+F6关闭控制程序，然后关电源。

设备运行结束，勿忘关闭自来水阀、空气源、蒸汽发生器。

开始控温前，必须先打开注水开关，直至排水口无气泡为止。

最高工作压力不大于0.20Mp，进罐空气压力应不大于0.20Mp！最高消毒温度126 ℃；公用工程要求：蒸汽：0.2~0.4Mpa; 水源：0.1~0.3Mpa1 技术指标1.1 概述具有温度、转速、空气流量、湿度显示和控制功能。

1.2指标1.2.1 温度：自动控制范围：冷却水温+5~50 ℃（±0.2 ℃)；显示范围：0~150 ℃1.2.2 搅拌转速：变频调速范围0~30（±5)rpm，时间比例控制正反转1.2.3 空气流量：显示控制范围0—50L/min1.2.4 湿度控制：50~100%1.2.5 罐体总体积50L，设计压力3.0kg/c㎡，最高工作压力1.5kg/c ㎡，设计工作温度131 ℃1.2.6 灭菌方法：手动控制蒸汽消毒灭菌1.2.7 主机功率：3KW（最大），单相220 V1.28气源要求：2~4kg/c ㎡1.2.9蒸汽要求： 2~4kg/c ㎡2 管路说明该流程图中空气管路阀门标号为“AXX”，蒸汽管路阀门标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”，冷冻水管路标号为“CWX”，其它气体管路标号为“NXX”。

2.1 空气及其净化来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气予过滤器）进入发酵罐空气总管，空气阀A01、空气流量计、阀A02、空气过滤器，阀A03到达加湿器内或经电磁阀C02进入发酵罐底部分布器，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量、净化作用。

注：空气流量显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。

如须测量控制湿度则开VT11关VT1。

2.2 蒸汽2.2.1 蒸汽进夹套蒸汽经阀S01进夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。

蒸汽对培养基预热。

（固体物料传热效率低，可以取消本步操作）2.2.2 蒸汽进反应器蒸汽经阀A02、空气过滤器、阀A03、电磁阀C02进入罐内，由排气口空气阀VT1排出。

蒸汽对过滤器及空气管线消毒2.3 自来水2.3.1 自来水进夹套当电磁阀大开时，自来水经多功能阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电热器、循环泵、单相阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。

特别提示：温度自动前必须对夹套注水。

2.3.2 自来水进排气冷凝器自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基的水分蒸发2.4 冷冻水（选配）（消毒后降温应优先采用自来水）冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线、经切换阀T04（关T03）返回了冷冻水回路。

2.8 纯氧管线（选配）纯氧管线：纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断阀A21进入空气过滤器。

纯氧流量调节：开C03、A21后调节流量计的调节手柄。

2.9空气流量检测与控制：空气热质量流量计：与空气玻璃转子流量计并联安装且在热质量流量计前后安装切断阀。

热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12,发酵结束后应及时关闭A11、A12。

2.10 补氨水管线氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制3 实罐灭菌操作3.1 准备3.1.1盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓。

3.2培养基预热3.2.1准备工作预先启动蒸汽发生器及空气压缩机将控制器中的温度控制设定为手动开排气阀VT1，关闭其它阀门湿度仪不耐高温和不可水浸，消毒后必须关闭排气旁通阀VT11。

3.2.2开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其它阀门。

3.2.3启动反应器搅拌马达。

调转速20~30Rpm3.2.4 蒸汽进夹套（固体物料可以取消本操作）缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽夹套（注意：此时有轻微爆炸声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢）。

待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸气冒出即可。

并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。

当培养基预热至98 ℃时，进入实罐灭菌操作。

在培养基温度在80~90 ℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度的区域内可以杀死大部分的微生物。

3.3实罐灭菌3.3.1蒸汽进过滤器：微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微加湿器底阀排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过滤器进入反应器，同时在控制器F5“空气”子画面中设定控制方式为“手动”并按F3输入“-100”后按“ENTER”，电磁阀C02在消毒过程中始终是开着的，以保正空气管线消毒彻底。

当冷凝水阀V02、V03出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜。

当排气口有蒸汽排出或罐温达到100 ℃两分钟后，关闭排气阀VT1。

调节切断阀A03和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为0.12~0.16Mpa，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。

3.3.2 当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸气排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，根据罐压或温度的变化趋势，及时调节蒸汽阀S02、S03。

阀门调节宜微调应避免大幅度开关。

当反应罐罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。

3.3.3 （略）3.3.4 保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸气冒出3.3.5 移种管线消毒（适用于多级发酵）在保温过程中开移种管线阀P03及受种阀前排水阀V04，保温结束前关闭V03。

3.4灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）3.4.1 保温结束首先旋紧接种口盖。

3.4.2关紧冷凝水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，用空气吹过滤器，当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭。