磷酸化蛋白质组学的研究及其应用郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。

近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。

本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法及其在生命领域的应用前景。

关键词：蛋白质；磷酸化；翻译；方法；检测在对疾病发病机制、诊断、生理功能及药物开发研究中，往往需要获取一些高通量、大样本、全局性数据，通过整体化系统性分析，从中寻找线索，推断可能的病因以及诊断靶标，由此诞生了诸如基因组学、蛋白质组学及代谢组学等建立在网络架构式研究思路基础上多种新的研究方法和理论。

生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应,这些反应过程靠复杂的调控机制调节,其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的,而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的[1]。

目前,已发现20多种蛋白质翻译后修饰,以至一种基因产物可呈现磷酸化修饰、糖基化修饰、羧基化修饰、乙酰化修饰以及连接变异体等多种形式[2]。

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。

磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性,以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。

蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等生命活动的所有过程,并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号转导方式[3]。

目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果[4]。

磷酸化蛋白质组学的研究尚处于初期阶段，鉴于其特殊的研究方法及内容，对揭示生命体尤其是疾病状态下细胞信号传导具有不可替代的优势[5-7]。

此外，磷酸化蛋白质组学的研究为寻找药物新的作用靶点和疾病诊断指标提供全新的研究思路。

本文就磷酸化蛋白质的检测、定量技术及其在生物领域的研究进行综述。

1.蛋白质磷酸化研究概况蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导中的核心,在生命系统中发挥着重要作用。

在真核生物中常见的三种磷酸化形式,丝氨酸磷酸化最多,苏氨酸磷酸化次之,而酪氨酸磷酸化最少,三者的比例是1800∶200∶1[8]。

丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的磷酸化是非常重要的蛋白质功能调节器[9],正确解析磷酸化蛋白质的结构以及为磷酸化的位点是磷酸化蛋白质组的主要任务之一。

另外,蛋白质磷酸化在机体内是动态的过程,不同条件下蛋白质磷酸化的定量分析是差异蛋白质组学研究的重要内容。

2.磷酸化蛋白质的主要检测技术2.1放射性标记法放射性标记法是研究蛋白质磷酸化的传统方法,是将用放射性同位素P标记的磷酸化蛋白质,经分离、富集后,利用放射自显影技术进行磷酸化蛋白质的检测。

若要进一步分析磷酸化位点,则需要通过蛋白酶解消化,再通过Edman降解或质谱对肽段进行测序。

此方法具有直接、灵敏度高的特点。

但由于存在有放射性污染;磷酸化、脱磷酸化的速率易受多种因素包括孵育时间等的影响;磷酸化、脱磷酸化变化慢而管家蛋白质的磷酸化不易测出,不能进行组织标记等局限性,故极大地限制了它的应用[10]。

2.2免疫印迹与免疫沉淀法此法是将蛋白质电泳分离后,用抗磷酸化氨基酸抗体与磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检出磷酸化蛋白质的较为常用的分析方法。

由于抗丝、苏氨酸磷酸化抗体抗原决定簇较小,使得抗原抗体的结合位点存在空间障碍,特异性较差。

所以很少被用来进行免疫印迹反应。

抗酪氨酸磷酸化抗体特异性较好,也最为常用。

由于磷酸化蛋白质含量很低,如果先用免疫沉淀对磷酸化蛋白质进行富集,这样可以降低非磷酸化蛋白质的干扰,提高检测的准确性。

随着抗体制备技术的改进,也有研究人员已经尝试用类似方法对丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质进行研究。

但是该方法也存在一定的局限性,如多检出高丰度蛋白质,需要大量的样品,抗体并非绝对专一性[11],许多非磷酸化蛋白质会出现假阳性结果。

2.3荧光检测法Pro—Q Diamond是Molecular Probes公司近年新推出的一种磷酸化蛋白质的荧光染料。

通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质,而对非磷酸化蛋白质的反应性很低,且荧光强度会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出一定的量的变化,在500～1000倍浓度范围内荧光染色的线性反应实现严格定量改变[12]。

因此可用于磷酸化蛋白质的差异表达谱方面的研究。

另外该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用,进行磷酸化蛋白质的定量。

其缺点是对于磷酸化程度不同的磷蛋白检测的灵敏度不同,不能检测出体内所有的磷酸化蛋白质。

3.磷酸化蛋白质的鉴定质谱技术是鉴定蛋白质的最基本手段,目前多采用质谱为基础的多种技术相结合的鉴定方法。

在串联质谱仪的前体离子扫描、中性丢失扫描等阴、阳离子模式下,磷酸肽经碰撞诱导解离(collision—induced dissociation,CID)产生的特异性片段,分别丢失80Da(HPO3)和98Da(H3PO)的子离子,检测所产生的全部碎片离子,根据碎片离子质量数来推断肽段序列和磷酸化位点。

此法已成功的用于ECG信号传导通路中磷酸肽的鉴定。

优点是高选择性、高灵敏度。

但由于受极性的影响不适合于联机使用。

电子捕获解离(electron capture dissociation ,ECD)结合傅立叶交换离子回旋加速共振(Fourier transforlm ion cyclotron resonance.F-ICR)质谱是最新发展的鉴定磷酸化蛋白质的技术。

该技术因可对酶切消化的肽骨架进行测序,保留磷酸化氨基酸的完整性,从而可以绘制出磷酸化蛋白质的真实谱图。

4.磷酸化蛋白质定量4.1稳定同位素标记法用15N、14N分别标记细胞蛋白质后混合培养,提取细胞蛋白,分离磷酸化蛋白质,酶解,最后进行质谱分析。

通过比较MS图中15N和14N峰的强度比进行磷酸化程度的相对定量。

这一方法需要在标记培养基中培养细胞,培养基的差异本身就有可能造成蛋白质表达量的变化,而且目标蛋白质需要纯化、分离,所以还不能用于大规模的蛋白质定量分析。

4.2同位素亲和标签(ICAT)法ICAT技术是利用两种不同的磷酸化蛋白同位素亲和标签试剂(phosphoprotein isotope coded affinity tags,PhIAT),预先选择性地标记某一类蛋白质。

磷酸肽或磷蛋白通过β-消除反应形成双键,同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应。

区别在于,其中一种试剂上的氢原子由氘代替,再在亲核试剂上连接一个亲和纯化标签,如生物素。

将两种细胞来源的磷酸肽或磷蛋白混合,酶解后提取含亲和标签的肽段并用质谱分析。

在质谱图中,根据两种亲核试剂标记的磷酸肽峰值比,进行该细胞蛋白质的相对定量。

Goshe等后来在此基础上又建立了磷酸化蛋白质同位素标记的固相标签技术(phosphoprotein isotope-coded solid-phase tag,PhIST)[13]。

其原理是将ICAT试剂与玻璃珠结合,使之固相化,通过固相捕捉和释放等化学反应过程后,LC/MS-MS分析蛋白质的肽段。

4.3亲和色谱结合同位素标记法两个样本分别采用不同的甲酯化试剂(甲醇和氘代甲醇),用亲和色谱将磷酸肽富集后进行LC—MS分析,通过分析成对磷酸肽的丰度比进行磷酸肽的定量研究。

研究者应用该方法分析了体外培养的肺癌细胞系,比较了在不同培养条件下的磷酸肽量的变化,列出了30多个磷酸肽的表达差异。

该方法的缺点在于成对磷酸肽的确认比较困难,需要专门的软件分析。

因为成对磷酸肽的质量数差值并不一致,这与该肽段中可甲酯化的残基数目有关。

同时还有部分谷氨酰胺残基发生脱氨基反应转变为谷氨酸也被甲酯化,更增加了分析的难度。

5.蛋白质磷酸化与疾病蛋白质磷酸化是细胞生物学效应的基本过程，许多疾病都表现为蛋白激酶和磷酸酶两者活性的失衡,常见疾病有囊性纤维化、阿尔茨海默病以及严重联合免疫缺陷病等。

蛋白质磷酸化还在细胞增殖调控方面发挥重要作用,激酶也是癌症发生的主要调控分子,细胞周期的程序控制主要通过各种细胞周期蛋白和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶有序地磷酸化和去磷酸化,从而控制cyclin-CDK复合物的活性来实现的。

cyclin-CDK复合物和磷酸酶,诱导一连串的级联式反应,通过对转录因子及其他功能蛋白的磷酸化和去磷酸化,实现各细胞期的功能。

近年来发现,人类多种肿瘤有cyclin基因的扩增和过度表达,导致CDK、cyclin-CDK复合物的活性增加细胞周期紊乱、细胞异常增殖而发生恶性转化[14]。

酪氨酸激酶家族成员参与了诸多癌症的发生和调控,其负调控常见于恶性转化[15]。

到目前为止,已知的致癌基因中有3/4是酪氨酸激酶的基因,发现多达30%的原发性胸腺和卵巢肿瘤以及40%的非小细胞肺癌表现为受体酪氨酸激酶ErbB2表达增加。

高水平表达的ErbB2蛋白可导致非配体依赖性二聚化和此激酶的组成性活化。

事实上,ErbB2过表达肿瘤的分析显示酪氨酸特异性蛋白磷酸化水平增加,ErbB2表达增加的胸腺肿瘤细胞株呈现MAPK活性增加。

此外,创伤后蛋白质磷酸化研究表明,新生大鼠在大脑皮质撞击伤后24h,海马蛋白质组中蛋白激酶Ｂ亚基(葡萄糖载体蛋白3和4、forkhead转录因子)磷酸化水平明显改变。

关于感染所致的蛋白质磷酸化也有报道:宿主在牛分支杆菌BCG感染或以其细胞壁成分磷脂壁酸孵育后,有数十种信号转导分子发生磷酸化改变,激发的信号转导瀑布导致应激活化蛋白激酶及其下游靶标C-Jun的活化。

而且分支杆菌感染还能诱导其他未知蛋白的磷酸化,如细胞骨架蛋白adducin、糖原合酶激酶β,以及参与调节胞内Ca2+水平的受体亚单位。

6.在其生物领域的研究6.1生物学领域蛋白磷酸化在生命各个环节甚至在整个生命科学均起重要作用。

截至2012年7月，Pubmed收录关于磷酸化的文献已经超过16万篇，其中绝大多数涉及蛋白磷酸化。

由于蛋白磷酸化研究的重要性，出现了跳出传统经典生物学，引申自“鸟枪法”为研究思路的磷酸化蛋白质组学。

磷酸化蛋白质组学，是一种基于全细胞内蛋白为研究靶标，全蛋白水平扫描不同蛋白的磷酸化程度，寻找新的磷酸化蛋白及新磷酸化位点，不断完善蛋白磷酸化体系，具有全面、可靠、高效及探索性的特点。

首先，磷酸化蛋白质组学以整个细胞所有蛋白为研究对象，研究内容囊括了细胞内所有具有生命功能的蛋白，如细胞增生、细胞周期、有丝分裂、细胞分化等所有相关蛋白，因而研究更为全面。