4
5
6
转 基 因 技 术
甲生物
取出优 “剪切” 秀基因 “拼接”
乙生物
表达
新类型
新的生物产品
基 因 敲 除 技 术
生物
敲 除 不 利 基 因
新类型
新的生物产品
7
一、基因操作常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯 键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
——1972～1973年，Berg和Cohen将成功 完成首个基因工程操作。
2
• 基因工程的主要操作步骤：
• 切——切开载体；切除供体DNA获得目的基 因； • 接——将目的基因与载体连接，（重组子）； • 转——将重组子转移到受体细胞中，(重组体); • 检——检查目的基因的转移和表达效果
3
体 外 操 作 与 细 胞 内 表 达
导入
扩增
3 导入途径
包括 生物法：转化、转染、 化学法：多聚物介导（如聚乙二醇） 物理法：显微注射、电穿孔、粒子轰击法
22
Hale Waihona Puke （四）目的基因的检测和表达
前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用， 通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的 受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出 来。
8
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
• １、限制性内切酶（限制酶）
• 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在 特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的 限制酶有200多种。 • ①分布：主要在微生物中。 • ②作用特点：特异性，即识别核苷酸序列，切割特 定切 点。 • ③结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 • ④举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
26
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
27
②
①
③
分子杂交实验
28
目录
13
二、基因的运输工具—运载体
要让一个从甲 生物细胞内取出来 的基因在乙生物体 内进行表达，首先 得将这个基因送到 乙生物的细胞内去！ 能将外源基因送入 细胞的工具就是运 载体。
14
1. 质粒载体（Plasmid）
• 质粒是指微生物细胞内 染色体外能自主复制的 裸露、双链、闭合环状 DNA分子，其大小可以从 1kb到500kb左右。 • 质粒的存在非常普遍， 几乎所有的细菌株系都 含有质粒。 • 可克隆的外源DNA片段一 般不超过10kb，能够在 受体细胞内利用受体细 胞的酶系统进行复制。
9
DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性 末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相 同的黏性末端，能够通过互补进行配对。
10
2、 DNA连接酶─基因的针线
• 连接酶的作用是： 将互补配对的两个 黏性末端连接起来， 使之成为一个完整 的DNA分子。 • 能够催化DNA中相 邻的3’-羟基和5’磷酸基末端之间形 成3′，5′-磷酸二 酯键，
18
RNA PCR 的原理图
19
（二）目的基因与运载体结合
用与提取目的基 因相同的限制酶切割 质粒使之出现一个切 口，将目的基因插入 切口处，让目的基因 的黏性末端与切口上 的黏性末端互补配对 后，在连拉酶的作用 下连接形成重组DNA分 子。 20
（三）将目的基因导入受体细胞并使之扩增
要让目的基因表达，必 须将它导入受体细胞并进行 扩增。 为获得目的基因的表达 产物时，通常以大肠杆菌等 无害易得的细菌为受体。为 改进某种生物时，将欲改进 的生物细胞为受体。 为使重组的DNA分子更容易 进入受体细胞，通常还要用 一些物质对受体细胞进行处 理，使受体细胞具有更大的 通透性。 21
例：用棉铃饲喂棉铃 虫，如虫吃后不出现中毒 症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。 如虫吃后中毒死亡，则说 明摄入了抗虫基因并得到 表达。
24
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
25
印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌 落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留 有表达产物的进一步培养、研究。
23
多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育 成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否 表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相 应变化的个体进一步培养、研究。
用限制酶切 断成许多片段
17
2.人工合成基因法
DNA合成仪
有两种方法： ①逆转录法：以信使 RNA为模板，在逆转录酶 的作用下将脱氧核苷酸合 成合成DNA(基因)。 ②直接合成法：根据 蛋白质的氨基酸顺序推算 出信使RNA核苷酸顺序， 再据此推算出基因DNA的 脱氧核苷酸顺序。用游离 脱氧核苷酸直接合成相应 的基因。
第 14 章 基 因 工 程 简 介
王章存 2011.06
1
基因工程的概念
也叫基因拼接技术或DNA重组技术。 它是在生物体外，通过对DNA分子进行人工 “剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和 重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖， 使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需 要的基因产物，也可定向地改造生物的遗传性状。
12
Taq DNA 聚合酶 (Thermus aqraticus)
• 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 • 结构：单亚基MW=94000d。 • 活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3′→5′ 外切酶活性，具5′→3′外切活性 。 • 用途： PCR反应。 测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结 构。
DNA聚合酶Ⅰ
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 , (4) 填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚 合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第 二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
15
三、基因操作的基本步骤
（一）目的基因的获鸟枪法（基因法）；PCR法（人工合成法）
供体生物细胞
取出DNA 用限制酶剪 去多余部分
限制酶
16
目的基因
提取目的基因的方法 1. 直接分离基因——鸟枪法
将供体生物的DNA用限制酶 切割为许多片段，再用运载体将 这些片段都运载到受体生物的不 同细胞中去。只要有一个细胞获 得了需要的目的基因并得以表达， 基因工程就算成功了。 该法最大的缺点是带有很大 的盲目性，工作量大，成功率低。 且不能将真核生物的基因转移到 原核生物中去。
11
3. DNA 聚合酶 （DNA polymerase）
DNA聚合酶
指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖 核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’ -OH末端聚合 DNA链的一类酶。 DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。 DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ（polⅠ）， 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ 参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA复制。聚合酶Ⅰ 是基因工程中的常用酶。