靛蓝和靛玉红的吸收光谱
靛蓝在608 nm处、靛玉红在544 nm处有最大吸收。
根据Lambert-beer定律A=EC分别计算出4个比吸光系数。
当波长为608 nm时，E608靛蓝＝34.6，E608靛玉红＝6.9； 当波长为544 nm时，E544靛蓝＝19.6，E544靛玉红＝44.6。
当溶液为2种物质的混合溶液时：
混合物在此二波长的△A即为b物质的△Ab（ A A2b A1b ）;
b物质的含量则可用在λ1及λ2处测得的△Ab对浓度作图所得标准
曲线上求出。
0.6
0.5
0.4
吸光度差0.3ຫໍສະໝຸດ 0.20.10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
对照品溶液浓度
紫外-可见分光光度法
测定步骤： （1） 选择双波长。先用标准品测出两组分各自的吸收曲线，选干扰 组分的吸收曲线上某对称两点（等吸收波长）的波长λ1和λ2，在此二 波长处待测组分的吸收度应有明显差别。 （2） 配制不同浓度的待测标准品，先在λ1处测出A1，再在λ2处测出 A2，求出∆A。用各种浓度下的∆A对浓度C作图，绘出标准曲线。 （3）混合物中待测组分的含量测定。在λ1和λ2处分别测得混合物的 A1及A2，求出∆A，由标准曲线上查出浓度即为待测组分浓度。
百分吸收系数：指100 m1溶液中含有1 g溶质，液层厚度1 cm时，
在指定波长和一定条件下所测得的吸收度，用 单位是克-1厘米-1。
或A1% 1c m
表示， E1% 1c m
摩尔吸收系数与百分吸收系数的相互关系为：
E1% 1cm
M
1 10
M：吸光物质的分子量（摩尔质量）。
紫外-可见分光光度法
物质的吸收系数与溶剂的种类、溶液的pH、温度以及波长有关， 测定时必需注意，表示吸收系数时这些条件应注明。 测定吸收系数时，将仪器的波长调至最大吸收波长（λmax）处。
紫外-可见分光光度法
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
对照品溶液浓度
总黄酮标准曲线
紫外-可见分光光度法
3. 直接比较法（单点校正）
凡溶液中待测物质吸收符合吸收定律，则配制一种浓度的标 准溶液，测其吸收度，再在同样条件下测样品溶液的吸收度， 根据下列公式求出样品溶液的浓度。
第二章 光谱分析法的应用
*光谱分析法：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散
射光谱系的特征来确定物质性质、结构或含量的方法。
光谱分析
吸收光谱分析 发射光谱分析
可见分光光度法 √ 紫外分光光度法 √ 红外分光光度法 √
原子吸收光谱法
荧光分析法 √
火焰光度法
散射光谱分析 比浊法
第二章 光谱分析法的应用
紫外-可见分光光度法
吸收度与溶液的浓度及液层的厚度成正比； *吸收系数（Absorptivity）：单位浓度、单位液层厚度的吸收度。
紫外-可见分光光度法
摩尔吸收系数：指1升溶液中含有1摩尔溶质，液层厚度为l cm时， 在指定波长和一定条件（溶剂、pH、温度）下的吸收度，用ε表 示，单位是克分子-1厘米-1。
第二章 光谱分析法的应用紫外-可见分光光度法
吸收光谱的吸收强度在实验上可用朗伯-比尔（LambertBeer）定律来描述。这条定律是吸收光的基本定律，也是吸 收光谱测量的理论基础。
当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能， 光的强度就要降低，溶液的浓度越大，液层的厚度越大，吸 收的光能越多，光强度减弱也越显著，可用下式来表示：
)样
(
E1% 1cm
)标
100%
样品%
2. 标准曲线法（常用）
从待测物质的吸收光谱图上选定某一 最大吸收波长，用一系列不同浓度的 标准溶液在该波长处分别测定它们的 吸收度。用吸收度对浓度作图，得标 准曲线。在同样条件下测定样品溶液 的吸收度，由标准曲线上可求出样品 溶液的浓度。
吸光度 Absorbance
假设a为干扰组分，b 为被测组分， 虚线则代表吸光度上反映的值。 又设在λ1和λ2处干扰组分的吸光度 值相等，于是 △A值反映在λ1和λ2 处b组分的吸光度差异。
Y X
x2 y1 x1
紫外-可见分光光度法
a的曲线在波长λ1和λ2处吸收度相等，△Aa＝0；
b物质的吸收曲线在Al和A2处A值相差很大，为△Ab;
紫外-可见分光光度法
一、分析测定方法
1．吸收系数法
在无标准品的情况下，利用
E1% 1c m
或 ε 进行定量。
从有关手册或药典中查得化合物的吸收系数，然后采用与标
准品相同的溶剂，配制样品溶液，在相同波长下测定A值，
按下式计算百分含量：
A
E1% 1c m
LC
C
A E11c%mL
在有标准品的情况下：
(
E1% 1cm
A608＝E608靛蓝×C靛蓝+ E608靛玉红×C靛玉红 A544＝E544靛蓝×C靛蓝+ E544靛玉红×C靛玉红 推导出：
C靛蓝＝1.54×10-3×A608－1.87×10-4×A544 C靛玉红＝3.65×10-3×A544－9.41×10-4×A608
紫外-可见分光光度法
5．双波长分光光度法
A样 C样 A标 C标
C标
C样
A标 A样
A标为标准溶液吸收度 C标为标准溶液浓度 A样为样品溶液吸收度 C样为样品溶液浓度
紫外-可见分光光度法
4．联立方程法
若待测样品为两种以上不起化学反应的吸收物质，如其吸收光谱并不 互相重叠，可按单位组分分析方法，分别在各组分的最大吸收波长处 测定，如其吸收光谱互相重叠，根据吸收度的加和性原则，混合物的 吸收度为各组分吸收度之和，可在各组分的最大吸收波长处，分别测 混合物吸收度，通过解联立方程的方法求得结果，如下式：
2
2
1
1
吸光度 Absorbance
0.40 0.35
.靛蓝 Indigo .靛玉红 Indirubin
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 230 280 330 380 430 480 530 580 630 680 730 780
吸收波长 Absorption wavelength/nm
光是电磁波，其能量（辐射能）可以用波长来表示
紫外-可见分光光度法
第一节 可见—紫外分光光度法的应用
物质吸收可见光和紫外光则引起价电子跃迁 物质吸收红外光则引起分子振动 紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱 *分子吸收光谱：当光通过固体、液体或气体的透明层时，分 子可以选择性地吸收一定波长的光，透过的光谱中就不出现 这些波长的光，这种光谱称为吸收光谱。