1.目的：本试剂盒用于定性检测α地中海贫血和β地中海贫血，可用于检测从人血液或血斑样本中获得的人基因组DNA中与地中海贫血相关的25个突变位点，包括19个β地中海贫血和6个α地中海贫血的突变位点。

检测结果可以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查、婚检及产前检测等领域。

2.责任人：3.适用范围：本标准化操作规程适用于晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（微阵列芯片法）整体解决方案操作使用的全过程。

4.PCR扩增：4.1 设备与耗材4.1.1 4℃/-20℃冰箱；4.1.2 超净工作台2台（分别用于PCR体系配制和模板加样）；4.1.3 微型高速离心机（Eppendorf，5424）；4.1.4漩涡混合器；4.1.5 PCR扩增仪（博奥生物集团有限公司，晶芯®E-Cycler TM96 PCR仪）；4.1.6单道移液器（1000µl，200µl，20µl），8道移液器（10µl），灭菌枪头（1000µl，200µl，20µl）；4.1.7 离心管架，96孔板，1.5ml离心管，PCR扩增管或八连排管（200µl）；4.1.8 记号笔，手套（无粉乳胶，PE）；4.1.9 75%酒精棉，废液缸和消毒液；4.2 试剂晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（微阵列芯片法）B部分中的扩增试剂A，B，C，D，E以及PCR扩增酶试剂，阳性对照品（博奥生物集团有限公司）。

4.3 样本人基因组DNA（提取方法详见干血斑基因组提取标准操作规程）。

4.4 实验前准备4.4.1 打开超净台紫外灯照射20min，开风机15min后打开日光灯进行操作；4.4.2 准备实验用品，包括PCR扩增试剂，离心管架，96孔板，移液器等；4.4.3 从-20℃冰箱取出PCR扩增试剂及基因组DNA，室温融化，涡旋混匀后瞬时离心；4.4.4 核对样本名称及数量，排好顺序，将样本的加样顺序记录下来。

4.5 操作过程4.5.1 用75%酒精棉擦拭双手，超净台面，移液器，96孔板及离心管架；4.5.2 按照加样顺序准备PCR反应管，并在管盖和管身同时做好相应标记；4.5.3根据样本数目准备5倍数量的200µl PCR扩增管，在试剂准备区内，将融化后混匀的PCR 扩增试剂A、B、C 、D、E按17µl/管，分别分装到5个PCR 扩增管中。

再分别向这5个PCR扩增管中加入3µl的PCR扩增酶试剂。

4.5.4 在模板加样区内，用75%酒精棉擦拭移液器、台面及双手，晾干后，向相对应的A、B、C、D、E系列试剂中各加入5µl同一样本核酸溶液，混匀，按照地中海贫血基因检测PCR扩增程序进行PCR扩增；4.5.5扩增：将PCR扩增管或八连排管置于PCR扩增仪中，按表2中的热循环程序进行PCR扩增反应；（扩增程序设定方法详见晶芯®E-Cycler TM96 PCR仪标准操作规程）5.芯片杂交：5.1 设备与耗材5.1.1 4℃/-20℃冰箱；5.1.2 芯片杂交仪（博奥生物集团有限公司，晶芯®BioMixer™ II）；5.1.3芯片洗干仪（博奥生物集团有限公司，晶芯®SlideWasher TM）；5.1.4杂交盒若干套（博奥生物集团有限公司，HybSet基因微阵列芯片杂交盒）；5.1.5单道移液器（1000µl，200µl，20µl），灭菌枪头（1000µl，200µl，20µl）；8道移液器（10µl，200µl）；5.1.6 离心管架，96孔板，1.5ml离心管、八连排管（200µl）；5.1.7 磁力架和磁力板；5.1.8 记号笔，75%酒精棉，废液缸；5.1.9 手套（无粉乳胶，PE）；5.1.10 15ml离心管。

5.2 试剂5.2.1 晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（微阵列芯片法）A部分中的磁珠、结合液、芯片；B部分中的杂交液缓冲液和PCR扩增试剂A、B、C、D、E，以及阳性对照品（博奥生物集团有限公司）；5.2.2 NaOH溶液（10 M），纯化水；5.2.3 20×SSC、10% SDS（博奥生物集团有限公司）。

5.3 实验前准备5.3.1提前打开杂交仪运行程序50℃预热（杂交程序设定方法详见晶芯®BioMixer II芯片杂交仪标准操作规程）；5.3.2杂交液：从试剂盒B部分中取出杂交缓冲液（白色盖），50℃温浴使其完全融化；5.3.3 变性液：根据需要量，用纯化水将NaOH 溶液（10 M）稀释100 倍，涡旋混匀得到变性液（0.1 M）（需每次新鲜配制）；5.3.4芯片：第一次使用时提前从4℃取出，平衡至室温再使用，开封后室温保存。

5.4 操作过程5.4.1 清洁与准备①用75%酒精棉擦拭实验台面双手，移液器，96 孔板及离心管架；②按照样本数量准备相应的离心管，并在管身做好相应标记；提示：以8份备检样本为例，需准备2个1.5ml离心管（分别配制磁珠及变性液）和5个200µl八连排管（用于放置产物，磁珠，变性液和杂交液）5.4.2 磁珠的准备以一份样本为例，涡旋振荡混匀磁珠与结合液，取离心管置于离心管架上，加入50µl结合缓冲液，再加入磁珠20µl，静置磁力架上吸附15 s，去除溶液。

将离心管撤离磁力架，再加入50µl 结合缓冲液，涡旋混匀。

5.4.3 磁珠纯化①检测一人份需用2个离心管，分别在2个离心管上进行标注，1号管和2号管；在1 号管中加入A体系PCR产物10µl和B体系PCR产物10µl，混匀；在2号管中加入C体系PCR产物10µl、D体系PCR产物10µl和E体系PCR产物10µl，混匀。

②向1号管中加入5.4.2中制备好的磁珠悬液20µl，向2号管中加入5.4.2中制备好的磁珠悬液30µl，混匀后静置10 min，期间在静置5min后需用移液器进行一次吹吸，以防止磁珠沉积。

然后，将产物-磁珠混合物置于磁力板上，吸附15 s，吸弃溶液，撤离磁力架。

③NaOH变性：再向1、2 管中分别加入新配制的0.1 M NaOH 60 µl，将聚集在离心管壁上的磁珠吹吸打散，充分混匀，静置10 min，期间在静置5 min后需用移液器进行一次吹吸，以防止磁珠沉积。

然后，将离心管置于磁力板上，吸附15 s，吸弃溶液，撤离磁力板。

★变性期间，分装杂交液于一干净的八连排管中，每一人份需要杂交液120µl,分装时每份大于120µl备用。

5.4.4 杂交反应混合物准备①向变性结束后的离心管中加入温浴后并充分混匀的杂交缓冲液40µl，对着管壁四周轻轻吹打，以去除干净管壁上残留的NaOH溶液，置磁力板上吸附15 s，吸弃溶液，撤离磁力板；②向上述管中加入杂交缓冲液20µl，将聚集在离心管壁上的磁珠吹吸打散，充分混匀，准备杂交。

5.4.5 芯片杂交①按照杂交盒托架（两侧凹槽各加50 µl纯化水）、芯片、盖片的顺序装配好杂交反应盒；②吸取14µl杂交混合物经加样孔加入芯片点阵中，注意不要加入气泡至反应池中，盖好盒盖并使用金属封条密封杂交盒，完成后将杂交盒平稳放入杂交仪托盘，并注意将三只或六只杂交盒全部放入，以使托盘平衡；★加样时注意顺序，一份样本需要同时进行两个点阵的检测，1号管检测点阵为1或3，2号管检测点阵为2或4。

③运行地中海贫血基因检测杂交程序见表3，杂交条件为50℃杂交1 h，转速为5 rpm；★杂交仪需提前打开预热20 min以上，待温度稳定后使用。

5.4.6芯片清洗①取出洗液原液（20×SSC，10%SDS），根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和Ⅱ；洗涤液I：依次将纯化水，20×SSC，10%SDS按照975：15：10的比例混合；洗涤液II：依次将纯化水，20×SSC按照997：3的比例混合；②预热SlideWasher TM芯片洗干仪，选择“加热”和“甩干”选项，按表4设置好程序后，点击“运行”。

待仪器屏幕显示“请放入芯片进行洗涤”的对话框时即可放入完成杂交的芯片，放入后点击“确定”开始运行地中海贫血基因检测洗涤程序进行洗涤，待洗涤完成后仪器屏幕显示“请将芯片放入甩干仓”时，点击“确定”即可将芯片对称的放入甩干仓，盖上仓门后自动进行甩干，等待甩干后点击“确定”打开仓门，取出芯片。

（洗干程序设定方法详见晶芯®SlideWasher TM芯片洗干仪标准操作规程）表4 地中海贫血基因检测洗涤程序★杂交结束提前10 min配置洗液，并预热洗干仪。

6.扫描判读：使用晶芯®LuxScan TM 10K/B微阵列芯片扫描仪和晶芯®地中海贫血基因检测芯片判别系统进行信号的读取及结果判断。

操作简介如下（详见晶芯®LuxScan TM 10K/B微阵列芯片扫描仪标准操作规程及软件用户手册）：6.1 开启扫描仪，运行地中海贫血基因检测基因芯片判别系统，预热激光10 min；6.2设置“保存路径”，输入芯片编号，样本编号等信息；6.3将完成洗涤、甩干的芯片插入扫描仪插槽内，即可进行芯片扫描和结果判读；6.4 完成判读的芯片需室温避光保存，并请详细记录判读结果和芯片信息；6.5 关闭激光，退出软件，关闭扫描仪。

7.说明：本试剂盒使用前请仔细阅览晶芯®地中海贫血基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）使用说明书和各仪器设备使用手册，并严格参照说明书执行相应操作。

8.相关文件：见附件。

9.记录模板：见附件。

10.历史修改记录：变更类型：A-增加M-修改D-删除。