ICS 67.220.10 X04备案号：25259-2009DB花椒麻味物质的检测方法高效液相色谱法Determination of numb-taste components in prickly ash －High performance liquid chromatography重庆市质量技术监督局 发布前言本标准中附录A、B为资料性附录。
本标准由重庆计量质量检测研究院提出。
本标准起草单位：西南大学食品科学学院、重庆计量质量检测研究院。
本标准主要起草人：阚建全、屠大伟、刘雄本标准由西南大学食品科学学院和重庆计量质量检测研究院负责解释。
花椒麻味物质的检测方法高效液相色谱法1 范围本标准规定了花椒麻味物质的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于花椒麻味物质的检测。
本方法最低检出浓度为0.044 μg/mL花椒麻味物质的待测液。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696：1987，MOD）3 术语和定义下列俗语和定义仅适用于本标准。
3.1花椒麻味物质 numb-taste components in prickly ash花椒麻味物质是花椒中呈现麻味的所有物质的总称，主要是由一类不饱和脂肪族酰胺组成，是花椒呈现麻味的物质基础。
4 方法原理试样经无水乙醚或甲醇提取，经甲醇定容，高效液相色谱分离，外标法定量。
5 试剂与标准品除非有另外说明，所有试剂应为分析纯，水为GB/T 6682-2008规定的一级水。
5.1 甲醇：色谱纯。
5.2 花椒麻味物质对照品，见附录A。
5.3 花椒麻味物质对照品贮备液（100 μg/mL的甲醇溶液）：准确称取100 mg花椒麻味物质对照品，在容量瓶中用甲醇定容至1000mL。
-10 ℃以下，可保存2年。
5.4 花椒麻味物质对照品使用液：分别吸取花椒麻味物质对照品贮备液（5.3）1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成分别相当于10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL浓度的花椒麻味物质对照品使用溶液。
6 仪器与设备实验室常规仪器设备和以下各项。
6.1 高效液相色谱仪：配有紫外可见光检测器。
6.2 分析天平：感量 0.0001 g。
6.3 色谱柱：C18反相柱。
7 分析步骤7.1样品处理7.1.1 整粒、块粒状、粉末状干花椒准确称取1 g(精确到0.01 g)粉碎后的样品，用滤纸包好，在索式脂肪提取器中用无水乙醚于45 ℃~55 ℃恒温水浴中回流提取12 h~18 h。
待乙醚提取液自然挥干后，再用甲醇定容至500 mL，并用0.45μm 滤膜过滤，滤液待测。
7.1.2 花椒（整粒、块粒状、粉状）的液态产品及鲜花椒将样品用组织捣碎机粉碎混匀后，准确称取3 g(精确到0.01 g)，置于具塞三角瓶中，用150mL的分析纯甲醇于40 ℃~50 ℃水浴中振荡浸提12 h~18 h后，再用砂芯过滤器（G1）过滤，滤渣用少量分析纯甲醇洗涤2次～3次。
洗涤液与滤液合并后，再将其转移到分液漏斗中，振摇2 min，静置分层后，收集甲醇萃取液。
甲醇不溶部分再用少量甲醇萃取2次～3 次，合并甲醇萃取液，定容至500 mL，并用0.45 μm 孔径滤膜过滤，滤液待测。
7.1.3 含花椒（整粒、块粒状、粉状）的固态产品这类产品按其是否含有油脂，可分为不含油脂的固态产品和含油脂的固态产品两类。
不含油脂的固态产品如整粒或块粒状或粉状的复合调味料等的预处理按7.1.1的预处理方法制备样品花椒麻味物质的待测液；含有油脂的固态产品如火锅底料等的预处理方法：首先加热使油脂熔融后，再按7.1.2的预处理方法制备待测液。
7.1.4 含花椒提取物的固态产品准确称取1 g(精确到0.01 g) 粉碎后的样品，置于具塞三角瓶中，用150mL的分析纯甲醇于40 ℃~50 ℃水浴中振荡浸提30min后，再用砂芯过滤器（G1）过滤，滤渣用少量分析纯甲醇洗涤2次～3次。
洗涤液与滤液合并后，再将其转移到分液漏斗中，振摇2 min，静置分层后，收集甲醇萃取液。
甲醇不溶部分再用少量甲醇萃取2次～3 次，合并甲醇萃取液，定容至500 mL，并用0.45 μm孔径滤膜过滤，滤液待测。
7.1.5 含花椒提取物的液态产品准确称取样品0.5g-1 g(精确到0.01 g)，置于具塞三角瓶中，用150mL的分析纯甲醇于40 ℃~50 ℃水浴中振荡浸提30min后，再将其转移到分液漏斗中，振摇2 min，静置分层后，收集甲醇萃取液。
甲醇不溶部分再用少量甲醇萃取2次～3 次，合并甲醇萃取液，定容至500 mL，并用0.45 μm孔径滤膜过滤，滤液待测。
7.2测定7.1.6 色谱参考条件色谱柱：DIKMA Platisil(铂金) ODS （250 mm×4.6mm）或其他等效液相色谱柱。
流动相：水-甲醇（v/v）。
梯度洗脱条件如表1。
进样量：20 μL。
流速：0.8 mL/min。
检测波长：254 nm。
表1 液相色谱梯度洗脱条件分别取20 μL 花椒麻味物质对照品使用液（5.4）注入高效液相色谱仪，在上述条件下测定花椒麻味物质对照品使用液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
7.1.8 样品测定取20μL 待测液（7.1）注入高效液相色谱仪，在上述条件下测定待测液的响应值（峰面积）。
由标准曲线上查得待测液中麻味物质的浓度，或利用回归方程计算待测液中麻味物质的浓度。
8 结果计算样品中花椒麻味物质的含量(x )以毫克每克（mg/g ）表示，按式（1）计算： (1)式中：x ——待测液中花椒麻味物质的含量（mg/g ）；c ——在工作曲线上查出或回归方程求出的花椒麻味物质的含量（μg/mL ）； m ——样品的质量（g ）；V ——待测液的定容体积（mL ）； 9 允许差在同一实验室，由同一操作者使用相同的设备，按相同的测试方法，对同一样品独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差不超过10%。
V1000c x m ⨯=⨯附录A（资料性附录）花椒麻味物质对照品的制备方法一、花椒麻味物质对照品制备的工艺流程花椒→超临界二氧化碳萃取→花椒油树脂→硅胶G逆流干柱层析→切割分离→分析纯甲醇萃取→合并Ds2、Ds3部分萃取液→制备型高效液相色谱纯化→冷冻结晶→结晶体Ds-A-B（花椒麻味物质对照品）二、操作关键点（一）花椒油树脂的制备采用超临界二氧化碳萃取法制备花椒油树脂，其萃取条件为：干花椒原料粒度40目，二氧化碳流量15kg/h，萃取温度为45℃，萃取压力为30MPa，萃取时间3h。
（二）花椒麻味物质的硅胶G逆流干柱层析分离（1）样品的预处理：将花椒油树脂与花椒油树脂2倍-3倍量的硅胶G拌匀，待花椒油树脂完全被硅胶G吸附后，风干待用。
（2）硅胶G逆流干柱的制备：选取层析柱（500mm×26mm），装上底部的转换接头后，向管内先装入少许玻璃棉，然后装入少量已活化的硅胶G约1cm高，边装边敲击，保证硅胶G装填均匀紧密；再装入混有样品的硅胶G（使其高度约为1cm），随后加入适量硅胶G使硅胶柱高约27cm，管口装入少许玻璃棉，最后接上导管，通过导管与滴液漏斗相接，展层剂（6%丙酮-氯仿溶液）装入滴液漏斗中。
（3）展层：打开滴液漏斗旋塞，使展层剂进入层析柱下端，利用液位差使展层剂逆流而上，待展层剂上升至距硅胶柱顶端1cm处停止展开；展层后的硅胶柱有8个色段，按由下至上的顺序，各色段颜色分别为褐色、绿黄色、浅黄色、淡绿色、灰绿色、墨绿色、白色、橙黄色。
（4）切割分离：拆下层析柱后平放于托盘中，轻敲柱壁，待吸附剂松动后，推出吸附剂，按各色段切开，置入通风橱中使溶剂完全挥干，再用分析纯甲醇萃取各硅胶色段，使吸附物溶出，得到8部分萃取液（Ds1-Ds8）。
（5）收集：将Ds1-Ds8配成适量浓度的甲醇溶液，测定其在254nm处的吸光度值并经感官试验，收集吸光度值大和麻味强的Ds2、Ds3部分。
合并Ds2、Ds3部分作为花椒麻味物质的粗品Ds-A。
（三）花椒麻味物质的制备型高效液相色谱（pre-HPLC）纯化取适量花椒麻味物质的粗品Ds-A，进行pre-HPLC纯化。
pre-HPLC纯化制备条件为：制备柱为Shim-PACK pre-ODS柱（250mm×20mm），洗脱剂为70%甲醇-水溶液，流速为5mL/min，柱温为室温，紫外检测波长为254nm，自动进样，每次进样量为0.1mL。
人工收集有最大吸收峰时的洗脱液（图A1），分别在旋转蒸发器脱溶后，用适量的热石油醚溶解，置于冰箱中冷冻结晶，得到花椒麻味物质的结晶体Ds-A-B，经过硅胶G薄层层析检验Ds-A-B为单一色点，制备型高效液相色谱（pre-HPLC）检验为单一对称峰，感官试验发现其具有浓烈的麻味。
因此，把Ds-A-B作为花椒麻味物质对照品。
图A1 花椒麻味物质在pre-HPLC的流出曲线（四）花椒麻味物质对照品的保存花椒麻味物质对照品（结晶体）可长期保存在-20℃下的石油醚中；花椒麻味物质对照品的甲醇溶液可在-10 ℃以下温度保存2年。
附 录 B （资料性附录）花椒麻味物质对照品使用液的液相色谱色谱图图 B1 花椒麻味物质对照品使用液的液相色谱图取花椒样品（整粒花椒粉碎后过40目）约1g (精确至0.001g)，置于三角烧瓶中，加入50 mL 甲醇，用保鲜膜封口，于50℃水浴浸提4h ，过滤，残渣用30mL 甲醇同法再提取1次，合并上清液，将滤液转移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm 微孔滤膜，即得花椒麻味物质样品溶液。
min0100200300400500600700800mVDetector A:254nm 2.570/66494.466/2070356.031/927016.660/21668312.583/18689220.611/64698121.500/12700723.617/59302524.534/1313680825.367/198104426.626/214425。