收稿日期：2014-07-14*通信作者：E-mail: mfliu@PIWI/piRNA “机器”与雄性生殖细胞发育戴 鹏，苟兰涛，刘默芳*(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，分子生物学国家重点实验室，上海市分子男科学重点实验室，上海 200031)摘要：PIWI (P-element-induced wimpy testis )蛋白在动物生殖系细胞中特异性表达，为动物生殖细胞发育分化所必需。

piRNA (PIWI-interacting RNAs )是最近在动物生殖系细胞中发现的一类非编码小分子RNA ，这类小RNA 特异性地与PIWI 家族蛋白相互作用。

PIWI/piRNA “机器”通过沉默转座元件和调控编码mRNA 等方式在动物生殖细胞发育分化过程中发挥重要作用。

本文围绕PIWI/piRNA “机器”的生物学功能及分子机制，对近期取得的相关研究进展进行了系统性总结。

关键词：PIWI ；piRNA ；转座元件；精子发生PIWI/piRNA machinery in spermatogenesisDAI Peng, GOU Lantao, LIU Mofang *(State Key Laboratory of Molecular Biology, Shanghai Key Laboratory of Molecular Andrology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)Abstract: PIWI proteins are specifically expressed in animal germ cells, and have been well demonstrated to be essential for germline development and gametogenesis. Recently, PIWI-interacting RNAs (piRNAs), a novel class of germ-cell-specific small noncoding RNAs, have been found associated with PIWI proteins. PIWI/piRNA machinery silence transposable elements and regulate the expression levels of mRNAs during刘默芳，女，博士，中国科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员，博士生导师。

2000年在中科院上海生化所获博士学位。

2000年至2006年分别在美国国家健康研究院国立癌症研究所(NIH/NCI )、约翰霍浦金斯医学院从事博士后研究、研究助理工作。

2006年起在中科院生化与细胞所工作。

获得2013年度国家杰出青年科学基金和2006年度上海市“浦江人才计划”等支持。

刘默芳研究组从事非编码RNA 功能机制研究，主要围绕piRNA 与哺乳动物精子发生、microRNA 与人类癌症等开展较系统的探索。

近期工作先后发现小鼠piRNA 及其结合蛋白MIWI 在后期精子细胞中协同降解的调控机制(Dev Cell 2013)、小鼠粗线期piRNA 指导父本mRNA 在精子形成后期大规模降解(Cell Res 2014)；同时还发现microRNA 在炎症相关肿瘤发生中具有极其重要的调控作用，是联系炎症-癌症的新介质因子(Cancer Res 2014；Cell Res 2014；EMBO J 2012；Cell Res 2012；Cancer Res 2010)。

这些原创性研究成果揭示了小分子非编码RNA 的生理和病理功能机制, 可为男性不育症及肿瘤等疾病的诊治研究提供理论依据和相关基础。

戴鹏, 等. PIWI/piRNA“机器”与雄性生殖细胞发育· 457 ·PIWI(P-element-induced wimpy testis)蛋白是Argonaute蛋白家族亚家族成员，特异性地在动物生殖系细胞中表达，为动物生殖细胞发育分化所必需。

piRNA是最近在动物生殖系细胞中发现的一类非编码小分子RNA，因它们特异性地与PIWI 家族蛋白相互作用，所以被称为PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA)，简称piRNA。

piRNA 起源于基因组中的反转座子、重复序列及其它被称为piRNA簇的区域，推测piRNA可能主要通过在表观遗传水平和转录后水平沉默转座子、反转座子等基因组移动遗传元件，维持生殖细胞自身基因组的稳定性和完整性，在配子形成过程中发挥重要作用。

目前，领域内对PIWI蛋白及piRNA的作用通路及功能已有越来越多的认识，但仍有许多科学问题还未被解答。

1 PIWI 蛋白Argonaute蛋白家族可分为AGO和PIWI两个亚家族成员，它们在物种间高度保守，并在小分子非编码RNA调控途径中发挥核心作用。

其中AGO 蛋白质成员特异性地与小分子干扰RNA(small in-terfering RNA, siRNA) 和microRNA(miRNA)结合，在多种组织器官中发挥重要功能[1]。

而PIWI蛋白质特异性地在动物生殖系细胞中表达，特异性地结合piRNA，在动物生殖细胞发育和配子生成过程中发挥多种重要功能[2-6]。

Argonaute家族蛋白质含有保守的PAZ(P iwi Ar-gonaut and Z wille)结构域和PIWI结构域。

结构及生化研究表明，AGO/PIWI蛋白质通过PAZ结构域与小分子RNA的3′末端结合，而PIWI结构域及MID结构域(the middle domain)结合RNA分子的5′末端[7-12]。

PIWI结构域含有RNase H的催化结构域，一部分Argonaute 成员具有核酸内切酶活性，可在对应于向导小RNA分子第10位与11位碱基之间切割靶RNA链[13-16]。

piwi是进化上非常保守的一类基因[17]，最早在果蝇中被发现，对果蝇生殖干细胞的自我更新和维持是必需的[18]。

随后，研究人员通过功能缺失突变实验发现，piwi基因缺失也导致线虫、斑马鱼及小鼠等模式生物生殖细胞发育受阻[19]。

这些研究表明，PIWI蛋白主要在动物生殖细胞中表达，其功能与生殖事件相关。

在小鼠中，PIWI蛋白家族包括三个成员：MIWI2、MILI和MIWI，它们在小鼠雄性生殖细胞的发育分化过程中呈现高度时空特异性表达。

MIWI2 从胚胎期15.5 d开始出现，持续表达至出生后3 d。

miwi2的缺失突变导致生精细胞发育停滞在第一次减数分裂的细线期，并伴有精原细胞的大量凋亡、DNA双链断裂及DNA甲基化水平降低所致的转座元件表达升高[20,21]。

此外，支持细胞中也能检测到MIWI2的表达，但其对于生殖细胞的功能并非必需[20]。

MILI从胚胎期12.5 d的原始生殖细胞中开始表达，并持续到减数分裂前后，到球形精子细胞阶段结束。

mili基因的缺失突变导致生精细胞发育停滞在第一次减数分裂的偶线期或者早粗线期[22,23]。

MIWI在出生后14 d的睾丸组织中检测到，在粗线期精母细胞高表达，并持续到减数分裂后的球形精子细胞中，在延长形精子细胞和长形精子细胞中逐渐减少，在成熟精子中完全消失；miwi缺失突变造成小鼠精子形成阻断在球形精子细胞发育的早期阶段，与调控精子发生的关键因子—CREM(cAMP-responsive element modula-tor)的缺失突变小鼠的表型相类似[24]。

2 生殖细胞中的piRNA2006年，四个独立的研究小组几乎同时在果蝇、小鼠、大鼠和人等物种生殖系细胞中发现了一类特异地与PIWI家族蛋白质相互作用的新型小分子RNA，被命名为PIWI相互作用RNA(PIWI-in-teracting RNA)，简称piRNA[2-6]。

而事实上，已有研究者最早在果蝇中发现，PIWI蛋白可以与一些来自逆转座子、异染色质区域重复元件的小RNA 特异性结合[25,26]，这些小RNA被称为rasiRNA(re-peat-associated siRNA)。

进一步研究发现，这些ra-germline development and gametogenesis. In this review, we summarize the recent progress of the functions and mechanisms of PIWI/piRNA machinery.Key Words: PIWI; piRNA; transposable elements; spermatogenesis《生命的化学》2014年34卷4期· 458 ·专题：RNA研究siRNA仅与PIWI家族蛋白(Piwi、Aub、Ago3)结合，而不与AGO家族成员相互作用，故这些rasiR-NA即是piRNA[27,28]。

已有的实验证据表明，piRNA具有以下特性：其主要成簇分布在长度在20~90 kb的基因簇上；成熟序列可来源于基因间区域、内含子及外显子序列[2-4]；其长度约为24~32 nt；可特异性地与PIWI家族蛋白质成员相互作用；它们的5′末端具有很强的U碱基偏好性[2,3,12]；其3′末端被2′-O-Me修饰，以保护其免受核酸外切酶降解[29,30]。

3 PIWI/piRNA“机器”的功能与机制3.1 piRNA的生成机制通过对果蝇、小鼠等物种的piRNA序列分析比对，推测piRNA分子可能通过两种途径生成：初级加工途径(primary processing pathway)和“乒乓循环”扩增途径(Ping-Pong amplification loop)。

已有的证据表明，大多数piRNA的序列都对应于范围较小的基因组区段，这些区域被称为piRNA簇(piRNA cluster)[2,3]。

piRNA簇在基因组中的分布可从若干kb至200 kb以上，每一个piRNA簇都可产生多种序列的piRNA，有些簇可双向转录产生piRNA 前体，而有些簇只有一条DNA链可生成piRNA。

研究人员推测，这些piRNA簇经转录得到长单链piRNA前体，随后再经过不依赖于Dicer酶的未知加工机制，生成初级piRNA。

在此过程中，可能首先由一种未知核酸内切酶切割长单链piRNA前体，加工产生成熟的piRNA 5′单磷酸末端，该前体即被装载到Piwi或Aub蛋白上，再由一个假定的核酸外切酶Trimmer加工产生piRNA成熟的3′末端，最后由RNA甲基化酶HEN1对piRNA 3′进行甲基化修饰，产生2′-O-Me修饰[31,32]。