常见生物相容性实验汇总细胞复苏材料准备：培养基、培养皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml离心管实验步骤：1.先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入5ml培养基；准备37℃的水浴，取出冻存管后立即置于水浴中融化，确保细胞全部浸入液面，快速摇动，1min内使管内的细胞融化，注意不要让水没过管口，液氮会从口子喷出，小心。

2.把培养基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜内操作。

3.小心打开冻存管，将细胞悬液转移到有培养基的15ml离心管中。

4.1200rpm离心3min，弃上清，加入6ml含10%FBS的完全培养基，转移至新培养瓶（小瓶6ml培养基，大瓶10ml培养基）中，做好标记（细胞类型、传代数、培养基、复苏时间、复苏人），置于CO2培养箱中37℃培养，培养24h后视情况换液。

5.复苏后细胞生长状况正常后，进行常规培养，最好在第二次传代后冻存若干管细胞，不可只取不存，在第三次传代后可用于细胞实验。

TIPS：a.解冻细胞必须迅速，防止细胞低温损伤，慢冻速融。

b.细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

细胞传代（TE消化法）实验前准备事项：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热（可以省去）。

2.用75％酒精擦拭双手，生物安全柜经过紫外线照射超过30min，实验前通风至少开启15分钟让空气循环起来，橱内不要使用火焰灯，它们会影响橱内空气的流动方式。

3.实验前把可能用到的试剂、吸管及离心管等全部拿到厨内，并正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

材料准备：TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、培养皿等实验步骤：1.观察细胞生长状况后，取出实验所需物品，可在50ml离心管中配制40ml培养基（4ml FBS+36ml α-MEM）待用。

2.用一次性吸管从细胞单层吸出培养基，缓慢加入PBS或者不含血清的培养基没过细胞，摇晃洗涤培养皿1~2次。

3.再吸出PBS或培养基，吸的越干净越好，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）TE（胰蛋白酶），以刚刚没过细胞为宜。

（视细胞种类也可不洗涤直接加入TE消化液）4.稍加摇匀，使TE消化液均匀覆盖皿内所有细胞，置37℃条件下温育1~3分钟。

消化程度以用肉眼观察当培养皿晃动时飘起单层细胞为准，可在显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，视细胞不同而调节。

5.消化适度后，加入适量培养基2~3ml于培养皿中终止消化，沿四个方向吹洗培养皿，确保细胞均从板上消化下来，最后全部转移到15ml离心管中。

6.用吸管将已经消化的细胞轻轻吹打成细胞悬液。

精确配平后放入台式离心机内1200 rpm离心3分钟。

7.弃上清液，加入适量PBS，重悬后1200rpm离心3分钟。

8.弃上清液，先加入2~3ml含10%血清的培养基于15ml离心管中，将适量细胞重悬液转移至含有培养基的6cm培养皿中进行培养，做好标记（细胞类型、传代数PxNy、培养基D-L-5、传代时间、传代比例1:5；操作人），置于CO2培养箱中37℃培养，清理操作台，处理垃圾，记录笔记。

TIPS：a.消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

b.胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，细胞从平板上脱落可以用枪头吹打实现，但必须观察到细胞间已经分离。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强，针对不同细胞，建议初次消化时均在显微镜下观察细胞形态以确定消化程度。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。

EDTA可以螯合2价金属离子，故常用TE溶液。

终止消化时，可用含有血清培养基或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用，利用培养基稀释也可以达到一定效果。

c.每次传代可以按1:3~1:10等比例进行，以ATCC数据建议和实际生长状况考虑，请协商好细胞需要立即使用还是长期培养，合理保持培养箱中不同细胞的平板数量。

d.用一次性吸管吹匀细胞时，切勿产生大量气泡，在气泡破裂时产生的剪接力对活细胞有致命威胁。

建议吸管在吸取液体前尽量排空气体，缓慢松手以吸取更多液体，继而以合适的力度吹匀细胞。

细胞冻存材料准备：TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次性吸管若干、专用冻存塑料管（1ml）等实验步骤：1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，冻存管必须将盖子盖紧，防止液氮侵入，并做好标记（细胞类型、培养代数、培养基、冻存时间、冻存人、编号）。

按下列顺序梯度降温：室温→4℃（10~20min）→冰箱冷冻室-20℃（0.5~1.5h）→低温冰箱-80℃（过夜）→液氮罐-196℃（长期）（冰上转移）。

5、整理，做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录（细胞信息、具体冻存位置、管数等）。

TIPS：a.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase)且存活率高之状态，约为80-90%致密度。

b.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

c.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。

d.DMSO稀释时会放出大量热能，为了防止局部DMSO浓度过高，请滴加培养基并且不时摇晃，当然，最佳的是配制好冻存培养基，加入离心管中对细胞沉淀小心吹打制悬。

e.梯度降温转移细胞时注意放置冰盒上，避免敏感温度变化。

不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

f.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

g.专用冻存塑料管，带有螺旋的平底塑料盖，并且可以耐受低温，注意冻存时拧紧。

细胞计数材料准备：細胞計數器、Eppendorf 管等实验步骤：1.制备细胞悬液，可稀释数倍以使每小格的细胞数可数。

2.取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3.将悬液摇匀，用移液器吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，不要使计数区两边平台沾上悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高，可用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。

4.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。

将细胞计数板放置于显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

5.细胞计数时，计数区是由4个16格小方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格(A、B、C、D)的细胞数，数完计4个大方格读数的平均数。

为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。

如细胞位于大方格的粗线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6.测数完毕，取下盖玻片，喷酒精将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。

洗净后自行晾干、滤纸吸干或用吹风机吹干，放入盒内保存7.细胞计数板-计数公式：计算公式：细胞数/ml=16小格内细胞总数×104×稀释倍数SD幼鼠骨髓间充质干细胞提取1.准备好已灭菌的手术器械和需要用到的离心管、培养皿等器材，于紫外照射30min灭菌。

2.先将培养基配好，并在培养皿中加入PBS和10% FBS Medium。

3.将出生7-8 天的SD幼鼠处死，喷酒精后放入超净台的培养皿中。

4.左手拿镊子将SD幼鼠后腿脚掌夹起，右手持剪刀沿着SD幼鼠后腿将皮剪开，且将皮剪至股骨部分，要将皮剪开点，以免沾到毛发。

找到股骨与身体相连的关节处剪断，取出后腿，并将脚掌与胫骨相连位置的皮剪掉，去除脚掌，余下部分放置于装有PBS的培养皿中。

5.重新取新一套镊子与剪刀，用镊子将腿夹起，在胫骨与股骨关节相连处用剪刀剪断，得到分离的胫骨与股骨。

6.左手用镊子将胫骨节气，右手持剪刀对骨头进行剔肉，尽量将骨头上的肉剔干净后，剪断胫骨两端的关节，使胫骨两端相通后放入装有10%FBS Medium 的培养皿中，股骨处理与胫骨相同。

7.用1ml注射器插入到骨髓腔中，并不断用medium进行吹打，直至腔体发白为止，再用1ml枪头吹打培养皿中的细胞，以免细胞成团。

8.用细胞滤网对培养皿中的细胞悬液进行过滤，去除液体中的组织和肉末，将滤液放入10 cm 培养皿中培养过夜。

9.第二天，去除上清液，PBS清洗两次（要沿壁加PBS，以免将贴壁不牢固的细胞吹起），再加入10% FBS Medium 培养。

（由于刚提取的细胞中含有多种杂质，刚提取的细胞经过过夜培养后，细胞上清液浑浊属于正常现象，在提取后的两天内，细胞要每天换液，且换液时候加PBS和10%FBS Medium 时候必须缓慢沿壁加入，以免将细胞吹起。

）10.2天换液一次，等到细胞长满之后，对细胞进行传代，传至第三代即可进行冻存和做实验用。

CCK-8实验目的：考察合金改性前后对对细胞毒性的变化细胞：小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1，大鼠骨髓间充质干细胞RBMSC实验原理：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。

细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。