夜后，用DEPC水洗净备用。
1.5移液枪的正确使用 1. 选择合适量程； 2. 对应合适枪头； 3. 吸液后轻放以避免将液体吸入到枪体内； 4. 用完后调回最大量程。
1.6安全注意事项 DEPC：焦碳酸二乙酯，是强的蛋白变性剂和致癌物。开瓶
时要使瓶子尽可能远离操作者，因为内部的压力可能导致飞 溅。操作中应戴上手套，并在通风厨中进行；
提取步骤： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即： ① 样品细胞或组织的有效破碎； ② 有效地使核蛋白复合体变性； ③ 对内源RNA酶的有效抑制； ④ 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； ⑤ 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可
采用两种途径:1、提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来； 2、直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相 而RNA留在水相。
2、总RNA提取的方法
（1）（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）
• TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰 酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离， 并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚， 而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机 层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相 层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
RNA提取注意事项：为防RNA降解，带手套、口罩，少说话； 试剂均为有机挥发试剂，有毒，需在通风厨操作，屏息，若不 小心沾到试剂立即用自来水冲洗
（二）琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴 定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分 子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液 等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中 的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到 荧光条带，籍此可分析实验结果。
分子生物学实验
2010-2011第二学期
目的：掌握分子生物学基本技术，主要包括 RNA提取、反转录、PCபைடு நூலகம்、电泳等
内容：罗非鱼18S基因的cDNA克隆 ①总RNA提取 ②电泳检测 ③cDNA合成 ④PCR扩增 ⑤PCR产物的分离、回收和纯化
时间安排： 5月24日 实验准备一：1.3去除RNA酶的实验用品处理 5月25日 实验准备二：灭菌干燥离心管、枪头 5月26日 总RNA提取和电泳检测 5月27日 cDNA合成和PCR扩增 5月28日 PCR产物回收和纯化
③ 室温，12,000×g离心3分钟，将上清液移至干净的1.5 ml离心管中，加入相同体积溶液B，颠倒混匀。
④ 将溶液置于离心柱中，静置2分钟，≥8000rpm 离心30S，若一次加不完，可分两次离心。
⑤ 用通用洗柱液洗两次。 ⑥ 短暂干甩后，用RNA洗脱液洗柱，室温离心干
燥30S ，溶解总RNA。 ⑦ 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。
要求： 1、分组实验，以小组为单位进行考核，即以各小
组实际的实验结果进行评分，不另外安排考试。 2、实验结果主要包括：总RNA电泳图、PCR电泳
图，每小组交一份实验报告，实验报告需对实验 结果进行分析讨论。
1 材料 1.1 实验鱼
罗非鱼购自农贸市场，碎冰速冻麻醉后分离垂体、肝脏 组织，立即置于TRIZOL试剂，或置于-60℃超低温冰箱 保存。
1.2 试 剂 1. 柱式动物RNAout（总RNA 提取试剂盒）
2. RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit （反转录试剂盒）
3. ExTaq PCR kit（PCR反应试剂盒） 4. E.Z.N.A Gel Extraction Kit（胶回收试剂盒）
（二）mRNA的提取
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为 有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（ A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲 液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓 度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两 次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
有机溶剂：RNA提取试剂为有机挥发试剂（硫氰酸胍-苯酚、 氯仿、异丙醇），均有毒，需在通风厨操作或屏息操作，少 讲话，以免将有毒气体吸入体内。若试剂不小心沾到皮肤上， 请立即用自来水冲洗；
EB：溴化乙锭，是诱变剂，具有高致癌性，配制使用时，应 戴乳胶手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是 接触过EB的器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或 弃去。
5. 100bp DNA Ladder
1.3 去除RNA酶的实验用品处理 ① DEPC水：每1L双蒸水中加入1mL DEPC，终浓度为0.1%，
于室温搅拌过夜，高压灭菌。 ② 金属解剖器具和玻璃器皿经180℃烘烤5小时，以灭活
RNA酶。 ③ 塑料离心管、枪头及枪头盒等塑料用品均用DEPC水浸
泡过夜后，高压灭菌烘干后使用。 ④ 琼脂糖凝胶电泳槽、制胶模具用3%的过氧化氢浸泡过
实验相关知识及操作方法
1. RNA提取 2. 琼脂糖凝胶电泳 3. PCR及反转录
二、RNA提取的基本原理与方法
（一）总RNA提取的基本原理与方法 1、原理
通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶 无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要 注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
总RNA提取（柱式动物RNAout） ① 从低温冰箱(–80℃)中取出肝脏样品，剪取小块（约为
50-100mg）后加入1 ml的溶液A，用1ml一次性塑料注射 器抽打匀浆。
② 匀浆液室温放置（15℃–30℃）1分钟以便细胞充分裂解， 每1 ml 溶液A加入0.2 ml的氯仿，用力振荡30秒后，室 温放置1分钟以便溶液分层，总RNA存在于上层水相中。