HPLC的使用与维护
基本原理和特点 液相色谱仪器部件 实验操作与应用 日常维护
基本原理和特点
➢ 基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分 配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留 时间不同,从而先后从固定相中流出.
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15
柱内 体积 (Vm)
0.10 mL 0.06 mL 0.03 mL
平衡时间 流速
0.2 mL/min
5 min 3 min 1.5 min
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
1.0mL/min
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气
等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求
水：
去离子水 自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂:
色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸
(mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积
(Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速
1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（UV/Vis）－ 优点
这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以
AU
Parabens at 254 nm
0.15
0.10
0.05
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
Minutes
吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点
由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波
染；
柱的保养：
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统
为何如此重要？
五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。
基线噪音对积分的影响
Caffeine @ 271 nm
1.183
1.183
1.224
维护流程图 线路过滤器
线路过滤器
流动相
线路过滤器 压力传感器
排液阀
故障：堵塞 现象：系统压力波动大或压力
偏高 措施：5％稀硝酸，超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出
口管路，设定流速1mL/min， 如压力>3kgf/cm2，则堵塞。
泵的保养：
使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值
（S/N）
6:1
检测限（LOD）：S/N = 2~4
定量限（LOQ）：S/N = 8~10
好的信噪比有利于：
更好的色谱峰确认
S
更好的定量
更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
吸光度（Absorbance UV/Vis）检测
目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50% 是多波长，25%是PDA）
灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。
样品池要保养
谢谢！
高效液相色谱仪组成
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
液相色谱的流动相
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
HPLC检测器应提供的功能
对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并
且所设计的校正技术应该促进这种关系
理想的HPLC检测器
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应
对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
单向阀
检测器 柱塞密封圈 进样器
吸滤头
吸滤头－－定期清洗，更换溶剂时 单向阀－－定期清洗，压力波动大时 泵－－自动清洗 在线过滤器－压力大时清洗
吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用5％稀硝酸，超声波清洗，
再用蒸馏水清洗
单向阀
故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施： 打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗
60 sec 36 sec 18 sec
色谱柱清洗保存
反相色谱柱：用20%甲醇溶液清洗10个柱体积，保存在 90%的甲醇溶液中。
分子筛色谱柱：用纯水清洗10个柱体积，保存在5%叠氮 化钠水溶液中。
离子色谱柱：用0.02M盐，pH6.5溶液清洗10个柱体积， 保存在含5%叠氮化钠0.02M盐，pH6.5溶液中。短期保存 在低盐的流动相中。
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕 量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
200.00
UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank
H20 with 0.1% TFA
50% ACN with 0.1% TFA
210.00
220.00
230.00
240.00
250.00 nm
260.00
270.00
长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响：
用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
背景吸收对紫外检测器噪音的影响
AU
1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的 固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适 的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
➢ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
流动相 脱气装置
四元泵
一些商品化仪器
检测器 柱温箱 样品盘
控温箱
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，
待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
滞后体积变化的影响
设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性