流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕 量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸
(mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积
(Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速
1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
60 sec 36 sec 18 sec
色谱柱清洗保存
反相色谱柱：用20%甲醇溶液清洗10个柱体积，保存在 90%的甲醇溶液中。
分子筛色谱柱：用纯水清洗10个柱体积，保存在5%叠氮 化钠水溶液中。
离子色谱柱：用0.02M盐，pH6.5溶液清洗10个柱体积， 保存在含5%叠氮化钠0.02M盐，pH6.5溶液中。短期保存 在低盐的流动相中。
对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值
（S/N）
6:1
检测限（LOD）：S/N = 2~4
定量限（LOQ）：S/N = 8~10
好的信噪比有利于：
更好的色谱峰确认
S
更好的定量
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
滞后体积变化的影响
设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比
梯度曲线
好的梯度 滞后曲线
保留时间
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求
水：
去离子水 自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂:
色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。
样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
每一次的加油，每一次的努力都是为 了下一 次更好 的自己 。20.11. 2520.11.25We dnesda y, November 25, 2020
更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
吸光度（Absorbance UV/Vis）检测
目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是 多波长，25%是PDA）
测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 µL inj. vol.） 检测： 214 nm
图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统
为何如此重要？
五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um 的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
Minutes
吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点
由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波
长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响：
用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
HPLC的 使用与维护
分析与制剂研究室 胡锋
基本原理和特点 液相色谱仪器部件 实验操作与应用 日常维护
基本原理和特点
➢ 基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分 配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留 时间不同,从而先后从固定相中流出.
2．梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成；
强溶剂 A%
② B 流动相/强溶剂组成；
③ 梯度时间；
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5 2 1
梯度洗脱
3 2 1
梯度：低压混合
低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积
如设计不当，梯度的 准确性受影响 滞后体积（系统 体积）设计合理
梯度滞后：系统体积的影响
低
B
压 AC
梯
D
比例阀
度
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
滞后(系统)体积
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
溶剂输送
高 系统(泵) 压
梯 溶剂输送 度 系统(泵)
进样器
梯度混合器
色谱柱
检测器
梯度滞后大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15
柱内 体积 (Vm)
0.10 mL 0.06 mL 0.03 mL
平衡时间 流速
0.2 mL/min
5 min 3 min 1.5 min
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
1.0mL/min
天生我材必有用，千金散尽还复来。14:30:5014:30:5014:3011/25/ 2020 2:30:50 PM
安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20. 11.2514:30:5014:30Nov-2025-Nov-20
得道多助失道寡助，掌控人心方位上 。14:30: 5014:30:5014: 30Wednesday, November 25, 2020
高效液相色谱仪组成
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
液相色谱的流动相
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
普通的低压梯度系统 梯度百分比
不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固 定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适 的溶剂进行洗净。
➢ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
流动相 脱气装置
四元泵
一些商品化仪器
检测器 柱温箱 样品盘
控温箱
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，
待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
口管路，设定流速1mL/min， 如压力>3kgf/cm2，则堵塞。
泵的保养：
使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污
染；
柱的保养：
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；