实验十血糖得测定
血液中得葡萄糖称血糖。
正常人血糖浓度较恒定,维持在3.9mmol／L～6.1mmol／L之间。
血糖浓度得相对恒定就是机体进行正常生理活动得前提条件之一,有着双重实际意义:其一,维持稳定得能源供给,满足机体在各种生理状态下对能量得需求。
其二,保证机体不因进食致血糖浓度过高,导致糖得丢失。
因此,血糖得测定就是临床生化检验实验室得常规检测项目。
血糖测定按其发展过程及反应原理得不同,大致分三类:氧化还原法 ,缩合法(主要有邻甲苯胺法),酶法(主要有己糖激酶法与葡萄糖氧化酶法)。
下边介绍两种方法供选择。
一、葡萄糖氧化酶法
【目得】
1、了解葡萄糖氧化酶法测定血糖得原理,能进行血糖测定得操作。
2、掌握血糖测定得临床意义。
【原理】
葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase,GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸与过氧化氢。
后者在过氧化物酶 (peroxidase,POD)作用下,分解为水与氧得同时将无色得4氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色得醌类化合物,即 Trinder 反应。
其颜色得深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比,在505nm波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血糖得浓度。
反应式如下:
【器材】
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计
【试剂】
1、 0、1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7、0)
称取无水磷酸氢二钠8、67g及无水磷酸二氢钾5、3g溶于800ml蒸馏水中,用1mol/L 氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调节pH至7、0,然后用蒸馏水稀释至1L。
2、酶试剂
称取过氧化物酶1200U,葡萄糖氧化酶1200U,4氨基安替比林10mg,叠氮钠100mg,溶于上述磷酸盐缓冲液80ml中,用1mol/L NaOH调pH至7、0,加磷酸缓冲液至100ml。
置冰箱保存,4℃可稳定3个月。
3、酚溶液
称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中(酚在空气中易氧化成红色,可先配成500g/L
得溶液,贮存于棕色瓶中,用时稀释),用棕色瓶贮存。
4、酶酚混合试剂
取上述酶试剂与酚溶液等量混合,4℃可以存放一个月。
5、 12mmol/L苯甲酸溶液
溶解苯甲酸1、4g于蒸馏水约800ml中,加温助溶,冷却后加蒸馏水至1L。
6.葡萄糖标准贮存液(100mmol/L)
称取已干燥恒重得无水葡萄糖1、802g,溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中,并移入100ml容量瓶内,再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml。
7、葡萄糖标准应用液(5mmol/L)
吸取葡萄糖标准贮存液5、0ml 于100ml 容量瓶中,加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。
【操作】
取3 支试管,编号,按下表操作。
表312 血糖测定操作步骤
加入物 (ml) 空白管标准管测定管
血清－－0、02
葡萄糖标准液－0、02 －
蒸馏水0、02 －－
酶酚混合液3、0 3、0 3、0 混匀,置 37 ℃水浴中保温 15分钟,在波长 505nm 处比色,以空白管调零,读取标准管及测定管吸光度。
【计算】
测定管吸光度
血糖(mmol/L)= ×5
标准管吸光度
【注意事项】
1.测定结果如超过20mmol／L,应将标本用生理盐水稀释后再测定,结果乘以稀释倍数。
2.若酶酚混合试剂呈红色,应弃之重配。
因标本与标准用量少,其加量就是否准确对测定结果影响较大,故其加量必须准确。
3.GODPOD法得第一步反应特异性高,而由POD催化得第二步指示反应就是非特异性得,易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物得干扰,这些物质与色素原竞争H202,使测定结果偏低。
4.Trinder反应由Trinder于1969年提出。
后经许多学者改进,采用2,4二氯酚、2羟3,5二氯苯磺酸等代替苯酚,由于这些化合物氧化生成得色素得摩尔吸光系数均高于苯酚,使反应灵敏度得以提高。
【正常参考范围】
3、9～6、1mmol/L
【临床意义】
1、生理性高血糖可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后,或精神紧张、交感神经兴奋,肾上腺分泌增加时。
2、病理性高血糖
⑴糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足得糖尿病患者。
⑵对抗胰岛素得激素分泌过多:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α细胞瘤等。
⑶颅内压增高:颅内压增高(如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等)刺激血糖中枢,出现高血糖。
⑷脱水引起得高血糖:如呕吐、腹泻与高热等也可使血糖轻度增高。
3、生理性低血糖饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。
4、病理性低血糖
⑴胰岛素分泌过多:由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。
⑵对抗胰岛素得激素分泌不足:如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退与甲状腺功能减退等。
⑶严重肝病患者:肝贮存糖原及糖异生功能低下,不能有效调节血糖。
【结果及分析】
【思考题】
1、血糖有哪些来源与去路,机体就是如何调节血糖浓度恒定得？
2、酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制,用蒸馏水就是否可以,为什么？
二、邻甲苯胺法
【目得】
了解测定血糖得原理与方法,要求在实验中培养学生严谨得作风与准确地进行实际操作得能力。
【原理】
葡萄糖在热得醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺,后者脱水生成雪夫(Schiff)碱,再经结构重排,生成有色化合物。
颜色得深浅与葡萄糖含量成正比。
其反应式
如下:
葡萄糖 + 邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺
H2O
葡萄糖邻甲苯胺雪夫碱
【器材】
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计
【试剂】
1.邻甲苯胺试剂
于940ml冰醋酸中加入硫脲1、5g, 邻甲苯胺60ml,混合,直至硫脲完全溶解,置棕色试剂瓶中,室温保存。
新配试剂应放置24小时后(待老化)使用。
此试剂腐蚀性强,避免接触皮肤,应用自动吸管加液。
2.12mmol/L苯甲酸溶液
于900ml 蒸馏水中加入苯甲酸1、4g,加热助溶,冷却后置于1L容量瓶中,加蒸馏水至刻度。
3.葡萄糖标准储存液(100mmol/L)
称取无水葡萄糖(预先置80℃烤箱干燥至恒重,移置干燥器内保存)1、802g,溶解于80ml苯甲酸溶液中,移置100ml容量瓶中,再加苯甲酸溶液至刻度。
4.葡萄糖标准应用液(5mmol/L)
取葡萄糖标准储备液5ml,置于100ml容量瓶中,加苯甲酸溶液至刻度。
【操作】
1.取16×150mm试管3支按下表进行操作:
表313 血糖测定操作步骤
试剂(ml) 测定管标准管空白管
血清或血浆0、1 ——
葡萄糖标准应用液—0、1 —
蒸馏水——0、1
邻甲苯胺试剂3、0 3、0 3、0
2.将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟,取出用自来水冷却5分钟。
注意在煮沸时水浴中得水面必须高于试管内得液面。
否则则温度不均而影响比色。
3.用波长630nm分光光度计进行比色,空白管调零点,读取测定管与标准管吸光度。
4.计算
测定管吸光度
血糖(mmol/L)= ×5
标准管吸光度
5.本测定法空腹血糖正常值为3、89～6、11 mmol/L(70～110mg/dl)。
【临床意义】同上。
【结果及分析】
【思考题】
讨论血糖升高与降低得临床意义及其维持恒定得因素？。