表 1 实验材料信息 Table 1 The information of tea plant material
编号 Code 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 名称 Name 龙井 43 白毫早 福鼎大白茶 铁观音 黄棪 乌牛早 名山白毫 长叶白毫 龙井 43 （重复） F1 代 -1804 F1 代 -1813 F1 代 -1814 F1 代 -1820 F1 代 -1907 F1 代 -1920 云抗 14 号 云选 9 号 云抗 43 号 福安大白茶 中茶 108 来源 Origin 浙江 湖南 福建 福建 福建 浙江 四川 云南 浙江 浙江 浙江 浙江 浙江 浙江 浙江 云南 云南 云南 福建 浙江
茶叶科学 2014 ， 34 （ 2 ） ： 180~187 Journal of Tea Science
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SNaPshot 技术检测茶树 SNP 研究
张成才 1，谭礼强
1,2
，王丽鸳 1，韦康 1，成浩
1*
1. 中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心， 浙江 杭州 310008； 2. 四川农业大学园艺学院，四川 雅安 614025
摘要： 为了提高茶树 SNPs 分型效率，促进 SNPs 在茶树遗传育种中的应用，研究了 SNaPshot 技术进行茶树 SNPs 分型的可行性。从实验室前期确证的 SNPs 中，选择 10 个作为目标 SNPs；使用 SNaPshot 技术在不同的 茶树品种中进行分型；然后，对分型结果进行比对和统计，以验证 SNaPshot 技术检测茶树 SNPs 的准确性、 重复性以及在茶树遗传多样性分析等方面的可用性。结果发现， 6 个 SNPs 分型结果与测序结果一致，准确率 为 60%；目标 SNPs 在龙井 43 及其重复实验中的分型结果完全一致； 6 个 SNPs 的等位基因数都是 2 ，期望杂 合度（ He）介于 0.37~0.52 ，观测杂合度（ Ho）介于 0.32~0.74 ，多态性信息含量（ PIC ）介于 0.36~0.50 ；结果 表明， SNaPshot 技术对茶树 SNPs 的分型准确性高、重复性好，可以用于茶树遗传多样性分析以及茶树遗传图 谱构建等方面的研究。 关键词： 茶树； SNPs； SNaPshot ；遗传多样性；遗传图谱 中图分类号： S571.1 ；Q52 DOI:10.13305/ki.jts.2014.02.014 文献标识码： A 文章编号： 1000-369X（ 2014 ）02-180-08
Abstract: In order to increase the genotyping efficiency of tea SNPs and promote th e application of SNPs in tea genetic breeding investigation, the feasibility of SNaPshot in SNPs genotyping of tea plant was investigated. Ten SNPs were selected from previous experiment as target SNPs. Then, these SNPs were detected in different tea cultivars by SNaPshot technology. Six among 10 SNPs were successful detected, with an accuracy of 60%. The polymorphism diversity of these SNPs was also analyzed. The value of NA was 2, He ranged from 0.37 to 0.52, Ho ranged from 0.32 to 0.74, PIC ranged from 0.36 to 0.50. All these markers were shown coincide between `Longjing43` and its repeated test. The markers reported here will be useful for tea genetic linkage map construction and genetic diversity study. The SNaPshot technology will promote the genetic study and accelerate the breeding process in tea plant. Keywords: tea plant, SNPs, SNaPshot, genetic diversity, genetic linkage map
根据 SNPs 类型差异或上下游序列结构的 差异，从实验室前期在 8 个品种（表 1）中确
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茶 叶 科 学34 卷 Nhomakorabea证的 SNPs [18]中，选择了 10 个 SNPs 作为目标 位点，使用 SNaPshot 方法在不同茶树个体中 进行检测。 SNPs 位点信息见表 2。 实验中，SNaPshot Multiplex Kit 购于 ABI 公司、 Platinum Taq DNA 聚合酶购于 Invitrogen 公司、SAP 和 ExoI 酶购于 Fermentas 公司。
－ 20℃保存备用。
使用
该技术成功检测了 77 个甜瓜的 EST-SNPs， 并 用于遗传图谱的构建， 展示了该技术在植物遗 传图谱构建研究中拥有的广阔前景。 茶树是多年生木本植物， 其遗传学研究远 远落后于其他作物。通过探索适合茶树的 SNPs 检测技术，促进 SNP 技术在茶树遗传育 种研究中的应用， 对促进茶树高密度遗传图谱
2期
张成才，等：SNaPshot 技术检测茶树 SNP 研究
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量丰富、分布广泛、突变率低、可以实现自动 化高通量检测等优点 ，在动植物的高密度遗 传图谱构建 [3-4] 、分子标记辅助育种 [5] 和遗传 多 样 性分 析 等 方 面 发挥 了 重要 的作 用。 目 前，多种检测手段已经用于 SNPs 的分型，如 以凝胶电泳为基础的单链构象多态性标记 （ PCR-SSCP ） 、酶切扩增多态性序列标记 (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence ， CAPS) 和 等 位 基 因 特 异 性 PCR 标 记 (Allele-specific PCR ， AS-PCR) 等；以及自动 化程度较高，可实现中、高通量 SNP 分型的 DNA 测序技术、飞行质谱检测技术和微测序 技术（ Minisequencing ）等 。 SNaPshot 技术也称微测序技术，是由美 国应用生物系统公司（ Applied Biosystems ， ABI）开发的一种 SNPs 多重分析技术，可实 现中通量的 SNPs 分型 。其基本原理是：首 先，使用引物扩增目标 SNPs 所在片段，在扩 增产物中加入核酸外切酶 I（ Exo I）和碱性磷 酸酶（ Shrimp Alkaline Phosphatase ， SAP）消 化掉反应体系中的引物序列和剩余的 dNTPs； 然后，以纯化后的扩增产物为模板，使用测序 酶、 双脱氧核苷酸 （ ddNTPs） 和 5′-端紧靠 SNP 位点的延伸引物进行 PCR 反应；最后，使用 测序仪和 GeneScan 等软件进行基因分型和数 据分析
[14]
1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂 选取龙井 43 等 13 个种植于杭州国家茶树 种质资源圃的茶树品种， 以及 6 个龙井 43× 白毫 早杂交 F1 代单株作为实验材料 （表 1） 。 分别采 摘一芽二叶新梢，使用改良的 CTAB 法提取基 因组 DNA[19]，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测基因 组 DNA 质量， 使用 NANODROP 2000C 型分光 光度计（Thermo Fisher Scientific, USA ）检测 DNA 浓度，将基因组 DNA 稀释到 30 ng· µL-1，
[7,9] [8] [7] [6] [2]
构建、精确地 QTL 定位，加快茶树育种进程 具有重要意义。目前，黄建安等 [15] 使用单链 构象多态性技术（ Single Strand Conformation Polymorphism ， PCR-SSCP ）方法研究了茶树 多酚氧化酶基因中的 SNPs 分布； 王丽鸳等 [16] 建 立 了 基 于 茶 树 表 达 序 列 标 签 （ Expressed Sequence Tag ，EST）数据库的 EST-SNP 开发 体系，筛选出 818 个候选 EST-SNPs，并使用 重测序技术成功确证了其中的 33 个 SNPs； 张 成才等 [17-18]建立了茶树 SNPs 的酶切扩增多态 性 标 记 （ Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS）和衍生酶切扩增多态性标记 （ Derived Cleaved Amplified Polymorphic sequence， dCAPS）转化体系，并分别对标记 的可用性进行了验证。然而，测序技术成本较 高 ， PCR-SSCP 技术 难以 获得位 点的准确 信 息，CAPS 和 dCAPS 技术检测效率较低 [7]。因 此，以上方法在进行大样本、多位点的 SNPs 分型时则表现出明显不足。而 SNaPshot 技术 检测成本低于测序技术，检测效率大大高于 CAPS/dCAPS 技术， 恰好能够弥补以上检测方 法的不足。本文探讨了使用 SNaPshot 技术检 测茶树 SNPs 的可行性，拟为促进 SNPs 技术 在构建高密度的茶树遗传图谱中的应用、 加快 茶树育种进程提供技术支持。
。该技术可同时进行多达几十个
SNPs 的检测，准确性高，检测速度快，成本 低廉。目前，已经广泛地用于人类疾病相关性 分析和法医学领域中的 SNPs 鉴定 [10-12]。在植 物遗传学领域中的应用相对较少。 Torjek 等 [13] 使用 18 组 SNaPshot 反应检测了拟南芥的 112 个 SNPs，指出该技术能够有效实现植物基因 组中多个 SNPs 的同时检测； Deleu 等