（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
1
2 3 4 5
简 特 经 直
便 异 济
准确
观
一般DNA实验室能满足实验 要求
Tagman探针技术（分子信标、分子灯塔） 实时荧光PCR技术 SYBR Green Ⅰ法（结合熔解曲线分析） 芯片分析（微阵列杂交实验技术）
特异性高；
引物设计简单； 反应条件易于优化；
分辨能力高。
随着科技的进步，SNP突变点检测方法在继续改进演 变。我们选择经济实用的技术方法来满足自己所做课题需 求。就目前来说，SNP检测技术手段还有待进一步提高。 科研在呼唤着一种最为理想的SNP检测方法，其能具 备以下优点: 1. 适合自动化操作, 简便快速;
基于PCR
荧光标记检测
相 关 技 术
寡核苷酸连接 分析
基于物理技术
内切酶酶切技 术
其它
单链构象多态性（SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
变性高效液相色谱分析技术（DHPLC）
(一)PCR-SSCP
1. 基本原理:
经PCR 扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经 高温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度 的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA , 可以因其顺序或单个碱基差异,所形成的空间构象就会不 同,其在凝胶中泳动速度不一样,从而显示出带型的差异, 即多态型
20bp
优势
局 限 性
序列多态性座位中大约只有1/3的
碱基涉及限制酶识别序列；
遗传标记系统的个人识别能力有限； 限制酶消化条件较高。
微测序技术（SNaPshot）
焦测序技术（Pyrosequencing）
(Minisequencing) 微测序法是近年来出现的一种基于特异等位基因的高通
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
适当降低镁离子及引物浓度有助于改善扩增特异性 TagDNA聚合酶用量根据扩增目的基因片段的大小适当 调整。 提高退火温度可明显提高扩增特异性。但不适当地提高退 火温度可能会招致假阴性。
SNP突变点检测方法
21世纪是生命科学的时代，随着
“人类基因组计划”的完成，揭开了人类 遗传信息的秘密。人类已了解自己基因组 的全部核苷酸序列，在全面寻找功能基因 的同时，“人类基因组计划”的另一个重
要目标是阐明在特定基因组区域内的序列
差异。
第1代标记：RFLP 第2代标记：VNTR 、STR
第3代标记：SNP
量SNPs 检测技术。
基本原理
首先设计一个引物,其3’端结束在突变位点前一个碱基 。然后在反应体系中加入ddNTP。只有ddNTP 与模板DNA 被检测位点处的核苷三磷酸互补时,延伸反应才发生,但仅在 连接一个碱基后就停止，通过检测延伸碱基所发出的荧光 来判断SNP类型。
基本步骤
扩增、引物延伸和分析。
9 kb的人类遗传图谱，这对开展致病基因的定位和人类起源 与进化的研究非常重要。 目前SNPs分析的基本方法已达20余种,参考相关文献，大 致分为八大类，现就重点介绍与我们课题组相关的实验方法。
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）
以构象为基础
引物延伸法
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
（一）、基本原理
根据等位基因（DNA一级结构）碱基序列的差异，设 计序列特异性引物进行的PCR扩增。 如某一等位基因是A-T或G-C突变，我们可以针对相应 的突变设计寡核苷酸引物，使其3’端的第一个碱基与等 位基因的特异碱基互补，这样特异性的引物仅扩增与其相 应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。扩增产物经凝 胶电泳检测，由是否有或无扩增产物的来确定相应的等位 基因。 目的等位基因是否得到有效扩增，可以通过测序来 确定。
2. 分析费用低, 特殊试剂少; 3. 反应要精密, 不纯的样品也可以可靠的分析; 4. 数据分析简单, 易于自动化; 5. 反应的通量 检测 结果分 析
DNA模 板制备
设计引 物
扩增反 应
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）

（三）、注意事项
1.引物设计：有时引物的3’末端与模板DNA之发生
间错配，而扩增产物并非是目的基因片段，可以通过 设计双重特异引物来克服该问题； 2.模板浓度： DNA模板用量并不是越多越好，以 适量为原则； 3.PCR实验条件的优化：
第4代标记：CNV
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）
定义：
单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置发生
了转换,颠换,缺失和插入等变化而引起的序列多态性，而且任 何一种位基因在群体中的频率不小于1%。 SNP在人类基因组分布广泛。某些SNP直接影响蛋白的结构 表达及遗传稳定性等。对基因组SNP的分析是研究个体, 系谱,
序列特异性引物聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction-sequence specific primer, PCR-SSP）
是由Olerup首先将其应用到HLA-DRB1基因分型，随后该技 术在基因分型实践中得到迅速发展和推广。目前我们课题 组的成员正实践着这一方法，初步结果令人满意。
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
由C-T突变
公共引物的 扩增产物
纯合子CC
联的 一合 扩 个分 增 基析 产 因， 物 型 。决 结 定果 由 物针 结对 果C 和的 针扩 对增 T 产
杂合子CT
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
RFLP定义：
由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出
现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长
度出现差异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长
度的差异，称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）

适用于大样本筛选
DNA模板纯度要求不高，所需量少
缺 点
1
2 3 4 不能检测变异的位置 随DNA片段长度增加，检测的敏感性降低 会出现假阴性结果 对A=T检出率无C G好，有局限性
等位基因特异PCR（AS-PCR） 序列特异PCR（PCR-SSP）
单管双向等位基因专一性扩增（SB-ASA）
……
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异
，它按照孟德尔方式遗传。
限制性内切酶Ⅱ识别DNA 序列上的的回文结构。
理论依据：RFLP分析和PCR技术联合应用
• PCR扩增目的基因片段
1
• 限制性内切酶酶切目的基因片段
2
• 电泳分离
3
野 生 型 纯 合 子
突 变 型 纯 合 子
杂 合 子
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保 持 在 单 链 状 态
非 变 性 凝 胶 电 泳
构 象 不 同 呈 现 多 态 性

DNA 单链构象同双链一样,也包括一级结构、二 级结构,其空间结构中最主要的是发夹结构。

发夹结构是决定DNA 单链构象多态性的分子基 础。
优 点
1
2 3 4
操作简单，步骤少，周期短 成本低
和人种特征以及遗传疾病治疗的重要线索。
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）
据估计,大约有105个SNP分子标记将被用于基因功能及与 疾病的相关性的关联研究。2001年, SNP协会( The SNP
Consortium)构建了含1. 42 ×106 个SNP、密度达1个SNP /1.
5’端为报告荧光基团 （reporter）
3’端为淬灭荧光基团 (quencher)
特 点：
1）该技术操作简单快速，特别适合少量位 点大量样本（几千个）的分型项目； 2）探针订购时间长（2－3个月）； 3）不适合少量样本（几十个）多位点分型, 特别是频率偏低的位点；
限制性片段长度多态性（RFLP） 随机扩增多态性DNA（RAPD） 引物入侵分析技术（Invader assay）