组氨酸 肝素
肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质， 肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量 为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。 到 ，它与凝血蛋白质、
亲和色谱 亲和配基 亲和色谱-亲和配基 色谱
亲和色谱 亲和色谱
-亲和色谱介质应满足条件 亲和色谱介质应满足条件 亲和色谱
如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳 香环或羟基链等疏水基， 香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位 上也含有疏水区， 上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性 相互作用
苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸和脯氨酸
生物亲和作用
-亲和作用中的相互作用力 亲和作用中的相互作用力
静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
介质的活化方法－ 介质的活化方法－环氧基法
环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高， 环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性 低的特点，是目前广泛采用的制备方法。 低的特点，是目前广泛采用的制备方法。 活化方法：将介质用水冲洗后， 活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和 适当浓度的NaOH，然后振荡反应 左右。 适当浓度的 ，然后振荡反应2.5h左右。 左右 为了得到更高的活化效率， 为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和 NaOH的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根 的用量， 的浓度， 的用量 的浓度 据具体实验做出调整。 据具体实验做出调整。 由于环氧氯丙烷为油相， 溶液为水相， 由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为 溶液为水相 了促进两者反应的进行， 了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶 剂二甲基亚砜（ 剂二甲基亚砜（DMSO）。 ）。
其它因素对亲和作用的影响
抑制氢键形成的物质
如果亲和结合作用中存在氢键， 如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲 和作用。 和作用。
温度
温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、 温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键 和配位键；增强疏水性相互作用 和配位键；
离液离子 螯合剂
亲和作用主要源于静电引力， 亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度 会减弱或完全破坏亲和作用； 会减弱或完全破坏亲和作用； 提高离子强度也会降低或消除氢键作用； 提高离子强度也会降低或消除氢键作用； 当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用， 当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用， 增大离子强度则可提高亲和结合作用； 增大离子强度则可提高亲和结合作用；
亲和作用中的氢键作用
亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原 结合部位之间形成O-H-O或O-H-N的氢键作用 子，结合部位之间形成 或 的氢键作用 氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直 线上，且原子之间的距离达到一定程度 线上， 氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格 制约
亲和作用中的疏水性相互作用
群特异性
亲和纯化定义 亲和纯化
将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与 固体粒子或可溶性物质共价偶联， 固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性 吸附或结合另一种分子， 吸附或结合另一种分子，使另一种分子从混 合物中得到选择性分离纯化的方法称为亲和 纯化。 纯化。 在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被 固定的分子称为亲和结合对象的配基。
含有目标产物的料液连续通入色谱柱 含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产 色谱 物在色谱 色谱柱出口穿透 物在色谱柱出口穿透
杂质清洗(contaminant 杂质清洗(contaminant washing)
利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质； 色谱柱除去不被吸附的杂质 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；
生物分离工程
亲和纯化技术
总体学习目的和要求
理解生物亲和作用的本质， 理解生物亲和作用的本质，影 响因素和作用体系。 响因素和作用体系。亲和纯化的原 理与操作。 理与操作。了解几种常用亲和纯化 方法。 方法。
目录
生物亲和作用 亲和色谱原理 亲和色谱 色谱介质 亲和色谱介质 亲和吸附平衡 亲和色谱 色谱的应用 亲和色谱的应用 亲和膜色谱 亲和膜色谱 其它亲和分离技术
三嗪类色素
这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用， 的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用， 这类色素与 的结合部位相同 能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、 能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生 结合作用
亲和配基－ 亲和配基－过渡金属等
过渡金属离子
Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生 亲和结合作用。 等过渡金属离子与N、 和 等供电原子 亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与 、O和S等供电原子 产生配位键。 产生配位键。
亲和配基－ 亲和配基－酶、抗体和蛋白
酶的抑制剂
蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分 布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（ 布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常 数为10 ），也有小分子化合物如氨基苄脒 数为 9 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数 ），也有小分子化合物如氨基苄脒（ 为4×104 L/mol）。 × ）
产物洗脱(target 产物洗脱(target product elution)
利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物
柱再生（ 柱再生（column regeneration)
利用清洗液清洗再生色谱柱 利用清洗液清洗再生色谱柱 色谱
亲和色谱介质－ 亲和色谱介质－学习要点 色谱介质
理解：间隔臂的作用， 理解：间隔臂的作用，常用亲和配基种类 应用：了解亲和配基的固定方法，应用实 应用：了解亲和配基的固定方法， 例以及亲和吸附介质的要求
生物亲和作用-学习要点 生物亲和作用 学习要点
识记： 识记：生物亲和作用的概念 理解：生物亲和作用的本质， 理解：生物亲和作用的本质，影响 亲和作用的因素 应用： 应用：了解常用的亲和作用体系
亲和作用的由来
Affinity一词源于拉丁语的affinitus，意为结 婚或亲缘关系
生物亲和作用-定义 生物亲和作用 定义
pH值对亲和作用的影响 值对亲和作用的影响
作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团， 作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团， 不同解离基团具有不同的解离常数； 不同解离基团具有不同的解离常数； 如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，pH 如果静电引力对亲和结合作用贡献较大， 值会严重影响亲和作用，即适当的pH值下亲 值会严重影响亲和作用，即适当的 值下亲 和结合作用较高，而在其他pH值下亲和结合 和结合作用较高，而在其他 值下亲和结合 作用减弱直至消失； 作用减弱直至消失；
亲和分配平衡
在亲和作用体系中，如果用L表示配基， 在亲和作用体系中，如果用L表示配基，E表示蛋白 质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为
E + L EL
结合常数 K eq
Kd
[E L] K eq = [E][L]
[E ][L] = [E L]
结合常数越大（或解离常数越小），表示亲和结合作用越强。 一般亲和体系的结合常数为104～108L/mol，最高可达到1015 L/mol，此时的亲和ห้องสมุดไป่ตู้合基本上不可逆的。
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 物理和化学稳定性高， 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子
亲和色谱 亲和色谱
-亲和配基固定化 亲和配基固定化
亲和配基的固定化方法
介质的活化
介质的活化方法－ 介质的活化方法－溴化氰法
亲和色谱原理-学习要点 亲和色谱原理 学习要点 色谱原理
理解：亲和色谱的原理与操作 理解：亲和色谱的原理与操作 色谱
亲和色谱定义
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 色谱 物质的液相色谱 色谱法 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲 和吸附介质（亲和吸附剂）
如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键， 如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入 乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失
常见的亲和作用体系
特异性 高特异性 亲和体系 抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
亲和配基－ 亲和配基－凝集素和色素
凝集素
凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。 凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上 具有糖的结合位点。可作为多糖、 具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的 配基。 配基。
辅酶和磷酸酰苷
各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。 各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。 辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。 辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。
亲和作用中的静电作用
中性pH值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、 中性 值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和 值下 半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、 半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨 酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电荷 N末端氨基酸 氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基 末端氨基酸α-氨基带正电荷 末端氨基酸 氨基带正电荷， 末端氨基酸的羧基 带负电荷 近距离上产生强烈的静电引力
溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配 溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配 色谱 基 最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至pH为11， 最初的溴化氰活化法，需要加入 至 为 ， 成功地将配基连接到软性介质上。但是， 成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是 剧毒试剂，并且具有挥发性。 剧毒试剂，并且具有挥发性。 溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解， 溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响 偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷， 偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非 特异性吸附增加等。 特异性吸附增加等。