基金项目：863子项目“特殊生境植物资源的开发利用技术”（No ：2007AA021401）转基因专项“转新型基因的棉花种质资源材料创造”（No ：2008ZX08005-004）。
第一作者简介：张煜星，男，1967年出生，副教授，博士生，从事植物基因工程研究。
通信地址：571101海口市城西学院路，中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室周鹏转张煜星，Tel ：015109875070，E-mail ：zyx2027193@ 。
通讯作者：男，1963年出生，研究员，博士生导师，从事植物基因工程研究。
E-mail ：Zhp6301@ 。
收稿日期：2009-04-16，修回日期：2009-05-07。
棉花accD 基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究张煜星1,2,3，崔燕3，祝建波3，周鹏2（1海南大学农学院，海南儋州571737；2中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室，海口571101；3石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003）摘要：乙酰辅酶A 羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。
采用PCR 方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase 羧基转移酶β-CT 亚基编码基因accD ，ACCase 羧基转移酶α-CT 亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。
将CAC3基因转运肽序列与accD 基因进行体外重组，构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD 。
重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。
渗透法转化拟南芥，收种子，在含卡那霉素的MS 培养基中发芽筛选。
用叶盘法转化烟草，经不定芽诱导、生根培养，获转基因烟草植株。
T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR 、RT-PCR 检测后，初步表明目的基因已在植株中转化成功，并可以正常转录。
关键词：陆地棉；拟南芥；accD 基因中图分类号：S336文献标识码：A 论文编号：2009-0791Construction of Plant Expression Vector on accD Gene fom Gossypuum hirsutumand Its Genetic Transformation Zhang Yuxing 1,2,3,Cui Yan 3,Zhu Jianbo 3,Zhou Peng 2(1College of Agronomy,Hainan University ,Danzhou Hainan 571737;2National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops,Institute of Bioscience and Biotechnology,CATAS,Haikou,571101;3Laboratory of Agricultural Biotechnology ,College of Life Science,Shihezi Universit ,Shihezi Xinjiang 832003)Abstract:The acetyl-CoA carboxylase (ACCase)is the rate-limiting enzyme of fatty acids synthesis.The accD Gene and transit peptide of CAC3Gene was amplified from Gossypuum hirsutum Genome and Arabidopsis thaliana Geneome.Plant Expression Vector of Fusion Transit Peptide of CAC3Gene and accD Gene was constructed.The Vector of pBI-CAC3tp -accD were transferred into Agrobacterium tumefaciens ing infiltration and leaf discs method,the gene were transferred into Arabidopsis thaliana and tobacco cell.The seeds of Arabidopsis thaliana were selected on solid medium containing Kanamycin.Transferred leafs of tobacco were selected on solid medium containing Kanamycin.Transgenic Arabidopsis thaliana (T1)and tobacco plants were found containing purpose gene by PCR.After RT-PCR,it shows that the CAC3tp -accD gene could transcript normally.Key words:Gossypuum hirsutum,rabidopsis thaliana,accD Gene中国农学通报2009,25(18):36-40Chinese Agricultural ScienceBulletin0引言乙酰辅酶A 羧化酶(acetylCoA carboxyl-ase ，ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶，是碳流进入脂肪酸生物合成的重要调控位点[1-4]。
生物体中ACCase 有2种类型，一种是异质型(heterom-eric)，另一类为同质型(homomeric)。
在构成异质型ACCase 的4个亚基中β-CT 较为特殊，它由叶绿体基因组中的accD 基因编码。
脂肪酸合成的前体是乙酰辅酶A ，它首先在ACCase 的作用下羧化形成丙二酰CoA 。
然后脂肪酸合成酶以丙二酰辅酶A 为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加两个碳的频率合成酰基碳链，进一步合成16~18碳的饱和脂肪酸。
高等植物中饱和脂肪酸的合成在叶绿体基质中进行[5]。
鉴于ACCase 在脂肪酸生物合成中的关键作用，人们期望能通过超量表达ACCase 基因提高油菜、大豆、芝麻和向日葵等油料作物的种子含油量。
如Roesler 等[6]将油菜种子贮藏蛋白napin 特异表达启动予与拟南芥同质型ACCase 基因ACC1融合，在大豆Rubisco SSU 转移肽的转运下，成功实现了定向将胞质溶胶ACCase 导入于油菜叶绿体，获得的转基因油菜T1代。
Davis 等[7]将噬菌体T7强启动子与大肠杆菌ACCase 酶4个亚基编码基因连接(accB 、accC 、accD 和accA 依次排列)，构建成一个细菌多顺反子，用其转化了大肠杆菌。
笔者根据NCBI 公布的陆地棉ACCase 羧基转移酶β亚基基因序列采用PCR 方法克隆了accD 基因，使该基因与拟南芥羧基转移酶α亚基编码基因CAC3中定位于叶绿体的转运肽相连，构建植物表达载体pBI-CAC3tp-accD ，用CAC3基因转运肽介导的叶绿体间接转化方法转化拟南芥和烟草。
为将来实现转基因植物的脂肪酸含量的调控奠定了基础。
1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料陆地棉（新陆早17号）由新疆农垦科学院棉花所惠增；哥伦比亚生态型拟南芥由北京大学蛋白质及植物基因工程实验室林忠平教授惠赠；烟草(Nicotiana tabacum var.Winsconsin38)由石河子大学植物病毒研究室刘升学博士提供，无菌苗由石河子大学农业生物技术重点实验室培养；烟草NC89由石河子大学农业生物技术重点实验室提供；1.1.2植物表达载体pBI121-CAC3tp-accD ，构建方法参见张煜星等[8]，由石河子大学农业生物技术重点实验室保存。
1.2方法1.2.1引物的设计根据NCBI 公布的陆地棉ACCase 羧基转移酶β亚基基因(accD )的序列，设计了一对引物P1：5-ATCGATATGGAA ATAGAGGCAAGAAAGC-3，P2：5-GAGCTCACAAAGTCA AAGCCCATT ACG C-3，在其上游引物5’引入ClaI 位点，在其下游引物5’引入SacI 位点。
根据NCBI 公布的拟南芥ACCase 羧基转移酶α亚基基因(CAC3)的序列，设计一对扩增转运肽（CAC3tp ）引物P3:5-TCTAGAGAACTCAACGCAA AAAATGGC-3，P4:5-ATCGATTACATCAACAATCTT CTTCTCCAA T-3，在其上游引物5’引入XbaI 位点，在其下游引物5’引入ClaI 位点。
1.2.2渗透法转化拟南芥将拟南芥的种子（T0）放于4℃春化3天，播种于花盆中，放于温室中，高湿度，强光照8h ，约经过2月，可进行转化试验，转化前浇水，使气孔打开，提高转化效率。
活化农杆菌pBI121-CAC3tp-accD 至OD 1.0左右，离心沉淀菌，去上清，用500ml 含5%蔗糖加表面活性剂Silwet-77100μl 溶解菌体，即可进行转化试验。
将开花的拟南芥倒置于烧杯中，浸没10min ，平放3min ，等水干后，用保鲜膜包裹，放于黑暗中16~24h ，撕去保鲜膜。
调整光照16h ，1个月后收集种子（T1代）。
将所收集的种子消毒后在无糖MS(含Kan 50mg/L)培养基中发芽，进行筛选。
培养基中加入Kan 200mg/L 继续进行筛选，将生长良好的幼芽由培养基转移到蛭石中，调整光照，1个月后可再次收集种子（T2代）。
1.2.3叶盘法转化烟草将农杆菌接种至含抗生素LB 固体平板上，28℃恒温培养24~48h ；挑取一单菌落接种至含抗生素的LB 液体培养基中，28℃恒温培养；取200μl 上述培养物，加入到20ml 含抗生素的LB 液体培养基中，28℃，250r/min 振荡培养4~5h ，至OD 600=0.3~0.4；将此培养物离心，收集菌体，用MS 液体培养基重悬菌体，即为转化用的侵染液。
取无菌烟草小苗的叶片，剪成1cm 2左右的小块（切掉叶边），将剪好的叶片放入农杆菌悬液中，放在28℃摇床上轻摇10~15min ，取出叶片，用滤纸吸干菌液，铺在共培养培养基（MS+6-BA 2mg/L +IAA 0.3mg/L ）暗共培养2~3天后转移到筛选培养基上（MS+6-BA 2mg/L +IAA 0.3mg/L +Kan 50mg/L+Carb500mg/L ）20天换一次培养基，大约2~3周可诱导出不定芽。