标准品 空白样品提取液稀释标准品
经过PBA净化和色谱分离后的样品基质效应很小
December 25, 2012
金刚烷胺在净化后的鸡肉样品中的基质效应
空白样品提取液稀释标准品
标准品
经过PCX净化和色谱分离后的样品基质效应很小
December 25, 2012
利巴韦林标准品,添加样品和空白样品的TIC谱图
线性范围 (Linear):0.1ppb～10ppb 稳定性(Stability)
金刚烷胺
Conc. 0.1ppb Area RSD 3.64
0.5ppb 2.50
1ppb 4.95
2ppb 0.64
5ppb 2.63
10ppb 2.60
December 25, 2012
利巴韦林在净化后的鸡肉样品中的基质效应
December 25, 2012
利巴韦林危害性
December 25, 2012
金刚烷胺 危害性
December 25, 2012
如何检测鉴定鸡肉中的抗病毒药物?
目前缺乏针对利巴韦林和金刚烷胺在动物源食品中的检测技术 方法和国家标准;
针对鸡肉样品中残留的抗病毒药物含量低,基质干扰大,急需有
物利巴韦林和金刚烷胺;
采用PBA和PCX分别可以有效的对鸡肉样品中的利巴韦林和金刚烷胺实现净化处理 ,净化后的样品基质效应小,添加回收率可达到70%以上（无同位素内标校正）; 采用6460QQQ分析结果表明在0.1ppb浓度下,利巴韦林的信噪比(S/N)=89;金刚烷 胺的信噪比(S/N)=63; 在0.1ppb～10ppb浓度范围内,线性关系和稳定性优异,相关系数R>0.999,峰面积 RSD<5%.
December 25, 2012
利巴韦林SPE萃取净化过程
Bond Elut PBA 500mg 6mL（P/N 12102105）
活化 1.5mL70:30水：乙腈（含有1%甲酸） 2.8mLpH 8. 5 的乙酸铵缓冲液，
上样
淋洗 10mL含有10%乙腈的pH 8. 5 的乙酸铵缓冲液
洗脱 抽干小柱，用5mL0.1Mol/L的甲酸洗脱，直接测定
Mobile Phase:
0.4 mL/min
A = Water(0.1%Formic acid+5mM Ammonium acetate) B = Acetonitrile Time 0.00 2.00 4.00 5.00 8.00 8.50 10.00 %B 0 0 15 15 30 98 98
平衡
保留
洗脱
苯硼酸萃取三步过程机理
Bond Elut PBA 能分析的化合物
苯硼酸可以保留包含二醇和其他基团的化合物例如： 1、邻-二醇，1,3-二醇， 1,3,5-三醇 对邻二醇的保留，要求化合物中的两个羟基共面或者是顺式结构。分子内部 的氢键键合使得1,3-二醇共面，因此该化合物可被保留。 2、糖类化合物 糖类化合物中的环表现出假回转，可以通过其他环而被保留。理论上将任何2 个或3个羟基隔开后可以充满三羟基化硼的四面体位点均有可能被保留。
标准品 添加样品
空白样品
平均回收率(Recovery)为82.8%
December 25, 2012
金刚烷胺标准品,添加样品和空白样品的TIC谱图
标准品 添加样品
空白样品
平均回收率(Recovery)为70.0%
December 25, 2012
总结 Summary
采用Agilent 1290 + 6460 QQQ在正离子模式下可以同时分析测定鸡肉中抗病毒药
效的前处理方法和高灵敏度的检测技术;
安捷伦科技能为客户提供从前处理到仪器分析完整的解决方案
WW Seminar Series 2006 Page 6
样品前处理解决方案
吴翠玲 CSD应用工程师 安捷伦科技（中国）有限公司
利巴韦林化学结构
易溶于水 存在顺式羟基 所以选择Bond Elut PBA作为萃取净化柱
乙酸铵(Ammonium acetate)
Poroshell120 EC-C18 3.0x100 mm, 2.7 µm:色谱柱部件号695975-302
December 25, 2012
LC Condition: Agilent 1290 Infinity
Injection volume: 2 mL Autosampler temp: 4 ºC
Agilent 针对分析鸡肉中抗病毒药物 利巴韦林(Ribavirin)和金刚烷胺(Amantadine) 的解决方案
2012.12
事件背景
近日,央视曝光违规喂食金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒药品的“速生鸡”流入 上海百盛旗下餐饮机构一事，引发沪上人士广泛关注!!!
December 25, 2012
结构性质
Column Temp:
Needle Wash: Column:
30 ºC
Flushport (50%acetonitrile+20%isopropyl alcohol+30%water), 6 s Agilent Poroshell120 EC-C18 (3.0x100 mm, 2.7 µm)
Pump Flow:
Bond Elut™ PBA 独特的硅胶基质的SPE 吸附剂，苯硼酸通过可逆 共价键来保留目标分析物 。这种强的共价保留机理可以保证高的特异性 和更干净的萃取效果。硼酸盐基团对包含顺式-二醇官能团的化合物具有 很强的亲和性，例如儿茶酚、核酸、一些蛋白、糖类和聚乙二醇化合物、 氨基醇、α-羟基胺、酮类化合物等。
洗脱液氮气吹扫浓缩至干，重新用30：70乙腈：水涡旋溶解后过膜 后，直接LC-MS/MS检测
Agilent 1290 Infinity+6460QQQ 仪器解决方案
李建中 LCMS应用工程师 安捷伦科技（中国）有限公司
测试试剂和材料
乙腈(Acetonitrile): Merck Lichrosolv® Hypergrade for LC-MS, Index No:608-001-00-3,1L/瓶; 去离子水(Water): Millpore, Milli-Q,18.2MΩ,TOC≤5ppb; 甲酸(Formic acid): DikmaPure HPLC Grade, 50mL/瓶;
Gradient:
Stop time: 10min Post time: 3min
December 25, 2012
MS Condition: Agilent 6460 QQQ
QQQ MS conditions Ion Mode: ESI/JetStream ESI, Positive
ESI conditions Drying Gas Temperature: 300 ºC Drying Gas Flow: 8 L/min Nebulizer Pressure: 40 psi Sheath Gas Temperature: 300 ºC Sheath Gas Flow: 11 L/min Capillary voltage (+): 3000 V Nozzle voltage (+): 0V MRM Condition: Timesegment1: 0min ΔEMV=400V
Timesegment2: 4min ΔEMV=200V
December 25, 2012
1ppb混标的MRM谱图
利巴韦林
金刚烷胺
December 25, 2012
灵敏度(Sensitivity)
0.1ppb利巴韦林, 2mL 信噪比(S/N,RMSx3)=89
0.1ppb金刚烷胺, 2mL 信噪比(S/N,RMSx3)=63
涡旋均匀后重新离心，取出一般体积滤液（5mL），过Plexa PCX固相萃取小柱……
鸡肉中金刚烷胺固相萃取过程
Bond Elut PCX 60mg 3mL（P/N 12102105）
活化 1.3mL甲醇； 2.3mL水， 上样 控制流速1mL/min以下 淋洗 3mL2%盐酸；3mL甲醇 ，抽干 洗脱 5mL5%氨水-甲醇-异丙醇（5+70+25）
Bond Elut PBA萃取机理
苯硼酸首先用碱溶液平衡，使苯硼酸根反应生成RB(OH)3，然后将包含二醇基的化 合物上样，与苯硼酸结合，释放水分子。一旦目标分析物被保留，可以在保留碱性 环境的前提下选择合适溶剂洗脱污染物，最终通过酸化苯硼酸复合物使得目标化合 物被洗脱，释放出带有二醇基的目标化合物，同时使苯硼酸转化为(RB(OH)2。
December 25, 2012
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December 25, 2012
线性范围 (Linear):0.1ppb～10ppb 稳定性(Stability)
利巴韦林
Conc. 0.1ppb Area RSD 2.39
0.5ppb 3.11
1ppb 0.87
2ppb ppb 3.00
December 25, 2012
洗脱液涡旋均匀后过膜，直接LC-MS/MS检测
金刚烷胺化学结构
利用金刚烷胺氨基特征官能团选择Bond Elut Plexa PCX作为固相萃取吸附剂 Bond Elut Plexa PCX 为聚合物基质的混合型强阳离子 交换固相萃取产品
鸡肉中的金刚烷胺分析
2g鸡肉样品（精确至0.01g）至15mL离心管中，加入加入已知 浓度的标准品、 5mL甲醇-1%三氯乙酸（50+50，V+V），涡 旋30s，超声30min，5000r/min离心10min，上清液全部转移 至15mL离心管中; 再加入 5mL甲醇-1%三氯乙酸（50+50，V+V）重复提取一次 ，合并全部滤液;