兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述题目：基因敲除技术研究进展作者：蒋成学号：201207749指导教师：谢放完成日期：2014-7-16基因敲除技术研究进展摘要：本综述主要阐明基因敲除技术近几年来的方法和步骤，以及在真核生物和原核生物中的具体实施，并运用实例形象阐明基因敲除技术的作用，以及其在国内的发展和以后基因敲出技术的发展前景，和一些在运用基因敲除技术过程中的问题。

关键字：基因敲除原核中断系统真核中断系统丝状真菌基因敲除1.引言：1.1概念：基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础[1]。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[2]。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

2012年初的敲除决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。

总之, 基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿，并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响，成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义[1,3]。

基因敲除是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法, 通过胚胎干细胞[2]这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏, 藉以揭示基因功能最直接的手段之一, 因此成为后基因组时代的重要研究方法和内容。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理[3]，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

1.2基本步骤：a.基因载体的构建：目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。

b.ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

而最常用的鼠的种系是129[4]及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

c.同源重组：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

d.选择筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo 基因的细胞，然后淘汰所有HSV -TK 正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。

将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠[2,6]。

e.表型研究：通过观察嵌体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

f.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

1.3其他基因敲出技术1.3.1.条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[4]。

它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre干预的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态[3]。

1.3.2诱导性基因敲除法诱导性基因敲除也是以C re/lox p 系统为基础，但却是利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的C r e 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利Cr e基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

1.3.3利用随机插入突变进行基因敲除此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

2.基因敲除技术的应用现状2.1原核生物中基因敲除技术的应用2.1.1基因敲除技术在丝状真菌中的研究现状（1）载体构建利用P C R技术辅助构建打靶载体[7]可以快速获得目的片段，即大肠杆菌质粒基因。

（2）载体中加入特殊的结构元件或采用特殊的报告基因,在打靶载体中，加入非同重组选择标记是提高筛选效率的一种非常有效的方法.（3）构建高同源重组率茵株等将粗糙链孢霉中与KU70、KU80(编码与非同源重组有关蛋白质的基因)同源的两个基因分别敲除，突变株的生长及产生的孢子都正常,但对于一些抗真菌药物比野生型菌株更加敏感对其进行基因打靶，转化子的同源重组率达100[5]，而对照的野生菌株只有109，6～309[5]‘等确定了构巢曲霉中与人KU70基因同源的基因，将之敲除后，菌株的生长和敏感性几乎影响，但是同源重组率大幅度提高，90以上的转化子在正确的位点具有单拷贝插入。

结合异源标记基因，建立了一个高效通用的构巢曲霉基因打靶系统(4)其他农杆菌的外源基因转化是目前植物转基因应用比较广泛的方法。

1998年用农杆菌干预转化了等丝状真菌，并证明异源的农杆菌T—DNA往往以单拷贝随机地插入到丝状真菌染色体中近，以宿主对比研究了农杆菌介导转化法与CaC1／PEG原生质体转化法[4,7]。

2.1.2基因敲除技术在基因功能和结构方面的研究现状作为研究基因功能和结构的最直接最有效的方法之一，为从分子水平研究病原菌致病、耐药机理，并为最终防治病害提供了强有力的手段。

烟曲霉是曲霉属中最常见的致病真菌，在免疫受损的患者中常引起有致命危险的侵袭性肺曲霉病。

等研究了烟曲霉erg3A和erg3B两个基因在固醇合成和对抗真菌药物耐受性中的作用。

分别敲除rg3A基因[1,20]、erg3B基因和将两个基因共同敲除，结果显示erg3B编码C-5固醇脱氢酶，而erg3A对烟曲霉麦角固醇合成没有明显的作用，3种突变株对两性霉素B，等抗真菌药物的敏感性没有改变L4。

构巢曲霉而被作为“模式”真核生物的一些丙酸盐可以作为丝状真菌的碳源，但是将它添加到含葡萄糖的培养基时又抑制真菌生长。

为解释这一现象，人们对构巢曲霉进行了研究，发现了柠檬酸甲酯循环。

Brock等进一步研究了这一机制，他们从构巢曲霉基因组序列中确定了上述循环中的一个关键酶——异柠檬甲酯酸裂合酶的编码基因，并将其敲除。

得到的缺失株在以丙酸盐为碳源的培养基上不生长，在以其它物质为主要碳源且含有丙酸盐的培养基上受抑制。

由此推论，柠檬酸甲酯循环的产物异柠檬甲酯是潜在的细胞代谢毒物。

2.1.3基因敲除技术在改良工业生产菌株中的应用现状丝状真菌与其它生产菌株相比有其独特优点，即具有很高的蛋白质分泌能力；能正确进行各种翻译后加工，包括肽链剪切等，且其糖基化的方式与高等真核生物的类似；丝状真菌如曲霉等作为生产菌株，已有成熟的发酵和后处理工艺。

但是丝状真菌用作工业生产菌株也存在一些缺陷，例如对外源蛋白质的表达量低，有的菌株会产生一些有害物质影响产品品质等。

基因敲除技术无疑给基因工程育种提供了一个有效的途径。

孙晶等以潮霉素抗性基因为标记，利用基因敲除技术将黑曲霉GICC2773中一种编码天冬氨酸胞外蛋白酶的基因敲除，功能分析显示突变株的酸性蛋白酶活性明显下降，外源蛋白漆酶的分泌表达提高，提示基因的缺失对外源蛋白漆酶的表达有保护作用。

2.1.4基因敲除技术次生代谢产物合成途径改造中的应用现状丝状真菌的许多次生代谢产物对人类的营养和健康有着非常重要的作用，如抗生素、stat类药物、有机酸、多不饱和脂肪酸等。

利用基因敲除技术可以有目的地对次生代谢产物生物合成途径进行改造，使代谢向目的产物积累方向进行。

2.1.5原核中断系统中的应用现状Red系统的机制：Red系统是原核中断系统的代表,由λ噬菌体bet、gam3个基因组成,它们分别编码Gam3蛋白质。

一种核酸外切酶,单亚基的分子量为24kDa,这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。

Ex蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端。

Beta蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25.8kDa。

在溶液中,Beta蛋白自发地形成环状结构,紧紧地结合在单链DNA3′末端DNA被单链核酸酶降解, 同时干预互补单链DNA的退火双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。

Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作且重组效率远高于重组2.2真核生物中基因敲除技术的应用将小鼠ESC中的卡巴B蛋白抑制因子的激酶2基因敲除[16],获得了杂合的IKK2突变体(IKK+/-2),杂合体在各个方面都是正常的, 通过杂合个体之间的交配, 研究者在很长时间内未能得到该位点纯合的个体,即I KK- / -2 个体。

在杂合状态时IKK2的表达只是受到了影响,但依旧有表达,而一旦纯合就意味着该基因的表达完全被中断,或者说即便有表达,表达出的蛋白质也不再是正常的IKK2。

随后的研究表明,IKK-/-2属致死基因型,该位点纯合的个体在胚胎发育的早期(125~135d)死亡。

原因是当无IKK2表达时,胎儿产生肿瘤坏死因子)引起早期胎儿的肝细胞发生大量凋亡,而在正常情况下,IKK2可抑制TNF引起的肝细胞凋亡。

那么能否拯救这样的纯合子个体呢?通过IKK+/-2与TNF基因被敲除的杂合子小鼠交配,获得了IKK+/-2/TNF+/-的个体,通过这种基因型的公母鼠的交配获得了IKK-/-2和TNF-/-的个体。

观察表明,IKK/-2/TNF-/-的个体可以存活到出生,但出生后一月内死亡[6]。

将线性化的针对小鼠凝血因子IX基因[2,6]的敲除载体用电穿孔法转入小鼠ES细胞,经G418筛选,用PCR和Southern杂交[15]的方法从具药物抗性的细胞中筛选出4个凝血因子IX基因被定向敲除的ES细胞克隆,为进一步开展基因敲除研究打下基础。

采用PCR扩增的方法研究了从美国德克萨斯大学引进的热休克因子1(Heatshockfactor1,HSF1)基因敲除小鼠的基因型。

结果表明,采用PCR扩增的方法,野生型小鼠仅在562bp的位置出现一条带,突变纯合子则在377bp处出现一条带,而突变杂合子则在562bp和377bp处出现两条带。