在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞．
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无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。
1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。
个器宫
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原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
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有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain
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培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长：
必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体
瘤细胞
悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生
长需要。
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人工合成培养基只能维持细胞生存，
要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量
的天然培养基（如血清）。
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血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
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培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培 养基和合成培养基。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染
4 无毒
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实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸
CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
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压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
器皿消毒
滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
超净工作台：为细胞操作提供无菌环境
紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
培养皿和培养板等表面消毒
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超净台
超净工作台的工作 原理是利用鼓风机
细胞培养基本技术
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细胞培养的基本概念
传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种
到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在
传代之前称为原代培养。
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细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或
薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整
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自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
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酶标仪
微孔板震荡器
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培养板
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培养瓶
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常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
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清洁液的配制
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2 细胞培养用液的配制
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl
8.0 g
KCl
0.2 g
Na2HPO4.H2O
KH2PO4 加水至1000 ml
1.56 g 0.20
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消化液：
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞
间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细
胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液
面。见于各种造血系统肿瘤细胞
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每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
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游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮
期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
10分钟一4小时
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贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4
小时贴壁。
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一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清．
对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的 复杂成分至今尚未完全清楚．
血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子 或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学 特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。
驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。
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滤器
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CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ℃ ，14 h)。 ③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
般为6～24小时。
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对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研
究。
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停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂
机制：接触抑制、密度依赖性
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培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
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合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数
量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培
养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化
合物、无机盐和其它一些辅助物质。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋
白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于
底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
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.胞分裂。细胞株潜伏期一