高铁血红蛋白还原试验比色法作业指导书
1.实验原理
有足量的NADPH存在下，反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶（即细胞色素b5，亦称黄酶素）还原成（亚铁）血红蛋白。

在体外，这一还原过程还需要递氢体亚甲基蓝的参与。

当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH的数量足以完成上述还原反应。

当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。

高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。

2. 标本：
2.1 病人准备：无特殊。

2.2 类型：枸櫞酸钠抗凝血（葡萄糖20mg）。

2.3 标本采集：在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L 枸橼酸钠溶液0.2ml，静脉血1.8ml，混匀。

3. 标本存放标本不宜存放。

4. 标本运输常温条件下运输。

5. 标本拒收标准抗凝剂不符合的、细菌污染的标本。

6. 实验材料
6.1. 0.18mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混合溶液
亚硝酸钠1.25g+葡萄糖5.0g+蒸馏水加至100ml；贮存于棕色瓶中，放4℃冰箱，可保存1个月。

6.2 0.4mmol/L亚甲基蓝溶液
亚甲基蓝（含3个结晶水）0.15g+蒸馏水加至100ml；先将亚甲基蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml容量瓶中，再加蒸馏水至100ml 混匀过滤，此液可贮存3个月。

6.1.3 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH
7.4）
磷酸氢二钠229.5mg+磷酸二氢钾52.2mg+蒸馏水加至100ml（或用0.0667mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液稀释3倍。

6.1.4 109mmol/L枸橼酸钠溶液（32g/L）.
7. 仪器722分光光度计，使用方法见其操作与维护规程.SOP文件。

8 操作步骤
8.1 将标本离心15min取出，调整血细胞与血浆比例为1:1后再混匀。

8.2 取上述抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲基蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。

8.3 孵育后混匀，取血0.1ml，加pH7.4磷酸盐缓冲液10ml，混匀，2min后在波长635nm处测定吸光度（设为SA）。

8.4 空白对照，用未加亚硝酸钠葡萄糖的血液，同样孵育后取0.1ml，加pH7.4磷酸缓冲液10ml，2min后
测定吸光度为B。

然后加入亚硝酸钠葡萄糖混合溶液1滴，混匀，5min后再测其吸光度St，此为高铁血红蛋白对照。

9. 计算：
SA－B
高铁血红蛋白还原率=1－
St－B
式中：SA－B、St－B分别为还原后和还原前高铁血红蛋白吸光度；
SA－B
为还原后剩余高铁血红蛋白的比值。

St－B
9. 检验结果的判断与分析高铁血红蛋白还原率在30%以下时，患者G-6-PD缺陷为纯合子，杂合子则呈中间值，多在74%-31%之间。

10 参考范围：高铁血红蛋白还原率应超过75%。

11 临床意义：减低：蚕豆病和伯氨喹啉型药物溶血。