补齐至50uL反应体系（购自大连Takara生物技术有限公司）。引物序列及PCR扩增条件见表1 (引物由 上海辉睿生物技术有限公司合成)。
1.3.2.2 RFLP酶切反应体系包括：PCR扩增产物17uL, 10 x buffer 2uL,内切酶（lOU/uL) luL,共 20uL体积(Thermo scientific公司，立陶宛),37T7JC浴16 h (各位点采用的内切酶见表1 )，酶切产物行3%
1.3.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测采用该法分析的位点包括：MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTR 2756A>G 和 RFC-1 80A>G� 1.3.2.1 PCR 扩增 PCR 扩增体系包括:10 x bu£fer(Mg2+free) 5uL�dNTP( 10 mmol/L )4uL,Mg2+( 20 mmoI/L) 3uL,正向引物（10 nmol/L) luL�反向引物（10 nmol/L)luL,模板 DNA5uL, Taq 酶�5U/uL) 1U,用纯水
叶酸代谢通路主要酶编码基因多态性与复发性流产的关联研究
罗丽陈岳明王莉卓广超袭春宁屠巧凤梅瑾张闻钱霞王贤军 325000温州，温州医科大学（罗丽）；310000杭州，杭州市第一人民医院浙江省杭州市共建 医学重点学科（陈岳明王莉袭春宁屠巧凤梅殖张闻钱霞王贤军）
【摘要】：目的：探讨叶酸代谢主要酶编码基因MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTR 2756A>G,
1.2标本采集空腹抽取外周静脉血2.0ml�加入含EDTA • K2抗凝剂的采血管内混勻。
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1.3方法 1.3.1基因组DNA提取选用全血基因组DNA提取试剂盒�Axygen公司，美国）提取基因组DNA�
操作步骤按照试剂盒说明书进行，纯化的DNA溶于150uL TE缓冲液中’置-301保存备用。
0.361, P<0.001),而 677T/1298A/2756A/66A/80G 增加 RPL 发生风险�OR=5.749, 95%CI=2.997 ~ 11.029, P<0.001)�结论：MTHFR 677T 和单倍型 677T/1298A/2756A/66A/80G 为 RPL 的危险因素，而 MTR 2756G
复发性流产(recurrent pregnancy loss, RPL)指自然流产连续发生两次或以上，育龄期妇女RPL发生 率约为1~2%[1，2]。导致RPL的原因包括父母染色体异常、母亲生殖器官解剖结构异常、内分泌代谢紊 乱（黄体生成不足、抗磷脂抗体综合征、甲状腺功能低下等)、免疫性疾病、凝血功能异常、药物毒物接 触、生殖道感染和环境因素等[3，4]。其它无明确原因的通常称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent
1材料与方法
1.1研究对象病例组136例为2013年1月至2014年5月我院遗传咨询门诊的孕妇，孕忘12周，有
>2
次不明原因自然流产史。病例组均行夫妻双方染色体核型分析、蛋白C�蛋白S�凝血功能、性激素、
甲状腺功能、绒毛膜促性腺激素、生殖道分泌物解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌培养、艾滋病病毒抗 体、梅毒特异性抗体、TORCH�抗核抗体、抗中性粒细胞抗体及乙肝三系检查。对照组为我院正常足月 分娩的孕妇，有> 1次健康儿生育史，无自然流产，无妊娠期高血压，无糖尿病，无异位妊娠，无早产史， 无血栓栓塞性疾病及家族遗传病史。所有人组对象均签署经杭州市第一人民医院医学伦理委员会通过的 知情同意书。
(48.1%), IT (7.4%). C (68.5%)和T (31.5%)；等位基因C�T在两组间分布频率差异有统计学意义，病例
组T等位基因分布频率显著高于对照组(OR=1.451, 95%CI =1.012-2.081, P=0.043),病例组�CT+TT) 基因型分布频率显著高于对照组(OR=1.700, 95%CI =1.024 - 2.821, P=0.039),两组CC�CT�TT各基 因型分布无统计学意义。MTR 2756G 为 RPL 的保护因素（C)R=0.509, 95%CI=0.272 ~ 0.952, P=0.032)� 两组间MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G, RFC-1 80A>G基因型和等位基因频率分布差异无统计学意 义。单倍型分析结果显示 677C/1298A/2756A/66A/80A 降低 RPL 发生风险（C)R=0.237, 95%CI=0.156 ~
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ห้องสมุดไป่ตู้
alleles of 5 loci between case and control were measured by Chi-square test.In addition,haplotypes were analyzed by SHEsis,one of online biological software. Results: The frequencies of genotypes and alleles of MTHFR 677C>T were CC (32.0%),CT(56.0%),TT(12.0%),C (60.0%),T(40.0%)in case group and CC (44.5%),CT(48.1%),IT (7.4%),C (68.5%),T (31.5%) in control group,respectively; Comparing allele C with T between the two groups,the prevalence of allele T was obviously higher in case group than in control group (OR=1.451，95%CI =1.012 �2.081, P=0.043); the frequency of genotype (CT + TT) was significantly higher in case group than that in control group (OR=1.700， 95%CI =1.024 �2.821，P=0.039), whereas there showed no difference among CC,CT and TT genotypes of MTHFR 677C>T.MTR 2756G showed a protective effect on RPL (OR=0.509,95%CI=0.272 ~ 0.952，P=0.032).In addition, no differences were found between case and control in the frequencies of alleles and genotypes of MTHFR 1298A>C, MTRR 66A>G and RFC-1 80A>G.Haplotype analysis revealed 677T/1298A/2756A/66A/80G could increase the risk of RPL (OR=5.749,95%CI=2.997 ~ 11.029, P<0.001). Conclusion: MTHFR 677T and haplotype 677T/1298A/2756A/66A/80G was a risk factor for RPL,MTR 2756G and haplotype 677C/1298A/2756A/66A/80A provided protect effect on susceptibility to RPL in fertile women in Hangzhou,China. Key words: Folate metabolism; Recurrent pregnancy loss; Gene polymorphism; Haplotype
琼脂糖凝胶电泳�70V�2h),置凝胶紫外成像仪�BioRad公司，美国）下观察酶切条带，分析基因型。
pregnancy loss,URPL)0
多项研究表明低叶酸水平，高同型半胱氨酸及叶酸代谢酶基因多态性与RPL存在明显关联[5_7]。因不 同研究背景人群基因型及等位基因频率分布差异较大，叶酸代谢酶基因多态性与RPL的关联国内外尚未 取得一致结果[5’94°]。此外，较多研究只关注亚甲基四氢叶酸还原酶�MTHFR) C677T以及A1298C基因多 态性对RPL的影响，而忽视对叶酸代谢通路中其他酶编码基因的研究� 鉴于叶酸代谢基因多态性在我国南北方人群分布差异较大[11]，我们采用病例-对照研究探讨杭州地 区育龄妇女叶酸代谢途径主要酶基因多态性与RPL发生的关联，为RPL的防治提供分子遗传学依据。
MTRR 66A>G和RFC-1 80A>G多态性与复发性流产(RPL)的关联。方法：随机选取杭州地区125例有 > 2次RPL史孕妇为病例组，135例生过& 1个健康婴儿且无流产史及其它明显疾病的育龄妇女为对照
组。MTHFR 677C>T, MTHFR 1298A>C, MTR 2756A>G 和 RFC-1 80A>G 基因型及等位基因频率分布采 用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测，并对部分结果行测序验证；MTRR 66A>G多 态性采用PCR后直接测序法检测。比较病例组与对照组间基因型、等位基因频率分布及单倍型情况，分 析叶酸代谢主要酶编码基因多态性与RPL的关联。结果：MTHFR 677C>T基因型和等位基因频率在病例 组分布分别为 CC (32.0%)、CT (56.0%), TT (12.0%), C (60%)和 T (40%),在对照组分别为 CC (44.5%)、CT
和单倍型677C/1298A/2756A/66A/80A为RPL的保护因素。