注射用重组人白介素—4外源DNA残留量的检测摘要目的检测本实验室生产制备的重组人白介素—4原液中外源DNA的残留量方法提取大肠杆菌基因组DNA，经过酶切变性处理后，加入地高辛标记探针，再用探针进行杂交实验。
结果包括DNA纯度及浓度检测、基因组DNA酶切效率的检测、探针标记效率的检测、杂交的免疫检测，显示五个结果均正常。
结论供试品（注射用人重组白介素—4原液）中外源DNA的含量小于0.1ng/μL，本批次产品合格。
关键词白细胞介素—4 外源DNA残留 DIG探针标记Detection of exogenous residues DNA from Injective RecombinantHuman IL-4Abstract Objective Detect the exogenous DNA in human recombinant interleukin - 4 concentrate residues which produced by our own lab. Method Extract E. coil’s genome DNA, deal with the enzyme denaturation, add tags digoxin probe, probe hybridization experiments. Test results including five: DNA purity and concentration, genomic DNA enzyme efficiency of detection, probe detection, the efficiency of hybridization of immune detection, experiment shows five results were normal. Conclusion The test shows that the samples (concentrate) employing recombinant interleukin - 4 injection of exogenous DNA content is less than 0.1 ng/mu L, so this batch product is qualified.Keyword Interleukin-4 the exogenous residues DNA DIG labeled probe前言基因工程药物中宿主细胞残余DNA对人体可能造成插入突变，导致抑癌基因失活，癌基因被激活等严重危害，外源大肠埃希氏菌DNA进入人体后, 可能导致肿瘤的发生[1]，因而对基因工程药物中外源DNA 的控制具有重要意义。
注射用重组人白介素—4中外源DNA经变性为单链后，吸附于固相尼龙膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成双链DNA，称为杂交[2]，应用DNA杂交技术，将特异性单链DNA经地高辛（DIG）探针标记后，与吸附在尼龙膜上的注射用重组人白介素—4单链DNA杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与地高辛标记的探针相结合，再加入碱性磷酸酶的作用底物CSPD，通过相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测注射用重组人白介素—4中外源DNA残留量[4]。
目前，基因工程药物在攻克肿瘤、心血管系统等一些疑难病症等领域，发挥着巨大的作用[8]。
本实验室生产的注射用重组人白介素—4，采用大肠杆菌作为工程菌，提取pET32a( + )载体与pUC18/ mIL24 质粒 ,用限制性内切酶NdeI 酶切得到带有互补粘性末端的载体和目的基因片段 ,用T4 DNA 连接酶连接后转入JM109中 ,涂布在加有氨卞青霉素的固体LB培养基上 ,培养过夜[11]。
挑取阳性菌落，经质粒酶切验证、DNA测序，确认质粒构建正确且无突变后 ,转入大肠杆菌BL21感受态细胞 ,从而获得pET32/ rmIL24 质粒的BL21(DE3)表达工程菌。
控制相关条件促使人的白介素-4基因（目的基因）表达，生产重组蛋白药物人白介素—4（约15KD）。
经目的基因工程菌的发酵，收集菌体沉淀，超声破菌后离心，3M盐酸胍洗涤，7M盐酸胍溶解，制得包涵体，逐步降低变性剂浓度复性后，再经脱盐、分子筛层析、离子交换层析等系列纯化后[3]，得到产品原液。
重组的蛋白产品功能一般与天然相似，但由于生产方法不同，其纯度要求、毒副作用和体内药物代谢动力学性质仍与天然的产品有很大区别[9]，所以对原液进行相关检测是必要的，外源DNA的含量超标，核酸残留量控制不好，可使药物产生毒副作用[7]，本实验借鉴southern blot的技术手段，应用DNA与DNA杂交的原理，检测产品原液中外源DNA的残留量，以达到质量监控的目的。
材料与方法1.实验材料1.1样品来源本实验室生产制备的重组人白介素-4原液。
1.2实验设备1.2.1实验器材名称厂家型号软片冲洗机虎丘影像科技（苏州）有限公司HQ—320XT 移液器1000μL eppendorf 100～1000μL 移液器100μL eppendorf 10～100μL 移液器10μL eppendorf 0～100μL 移液器2.5μL eppendorf 0～2.5μL 1.2.2实验材料名称厂家型号细菌基因组DNA提取试剂盒TIANGEN Biotech H7208 DNA酶切BsuRI(HaeⅢ) fermentas ER0151 杂交试剂盒（Detection Starter KitⅡ）Roche 11585614910 马来酸成都科龙试剂厂500g 氯化钠天津海龙药业有限公司1000g 氨基丁三醇重庆青阳药业有限公司500g 柠檬酸钠成都科龙试剂厂500g SDS(十二烷基硫酸钠) 湖南尔康制药有限公司500g 甲醇成都科龙试剂厂500mL 冰醋酸成都科龙试剂厂500mL1.3 溶液配制1×TAE：量取8mL 50×TAE（称取Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g于1L烧杯中，加入800ml无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm），充分搅拌溶解。
加入57.1ml冰醋酸，充分混匀，继续加入无菌水定容至1L。
）加至382mL无菌水中，混匀，室温保存。
washing buffer（1L）：称取马来酸（顺丁烯二酸）11.6g，氯化钠8.775g, 适量无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）溶解，调pH至7.5，定容至1L后，加入3ml 0.3%吐温20，充分混匀。
maleic acid buffer（1L）：称取马来酸（顺丁烯二酸）11.6g，氯化钠8.775g,加入适量无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）溶解，调pH至7.5，定容至1L。
blocking buffer（1×）：用Maleic acid buffer稀释试剂盒中的blocking buffer 10×（瓶号⑥）至1×，即取2mL 10× blocking buffer加入18mL Maleic acidbuffer,现配现用。
抗体溶液：试剂盒中的抗体（瓶号④）溶液经10000r/min，5min离心，取上层液体用1×blocking buffer 1：10000稀释（1μL抗体溶液+ 10mL1×blocking buffer）。
detection buffer：称取Tris碱12.1g，NaCl 5.85g，适量无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）溶解，调PH至9.5，定容至1L。
1%蛋白酶K溶液：称取蛋白酶K 0.1g,溶于10mL无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）中,分装储存﹣20℃。
0.3%牛血清白蛋白溶液：称取BSA 0.3g,溶于1mL无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）中,分装储存﹣20℃。
蛋白酶缓冲液（pH8.0）：量取1M Tris溶液（PH8.0）1mL、5M NaCl溶液2mL、0.5M乙二胺四乙酸二钠溶液（PH 8.0）2.0mL、20%SDS溶液（PH 8.0）2.5mL，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）至10mL。
TE缓冲液（pH8.0）：量取1M Tris溶液（PH8.0）10mL、0.5M乙二胺四乙酸二钠溶液（PH8.0）2.0mL，加UP水（电阻率＞18.2MΩ.cm）至1000mL。
1%鱼精DNA溶液：精密称取鱼精DNA 0.1g 于10mL量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于﹣20℃。
DNA稀释液：取1%鱼精DNA溶液50μL，加TE缓冲液至10mL。
20×SSC（1L）：称取氯化钠175.32g，柠檬酸钠88.23g，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）1L溶解。
1%SDS（1L）：称取10g十二烷基硫酸钠溶于1L无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）中。
2×SSC 0.1%SDS（1L）：取100mL1%SDS，100mL20×SSC，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）800mL，混匀。
1×SSC 0.1%SDS（1L）：取100mL1%SDS，50mL20×SSC，加无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）850mL，混匀。
2.实验方法2.1 培菌(PET32a-NdeI-hil4，于2007年5月保种)2.1.1 配制LB培养基：称取蛋白胨2g、酵母浸出物1g、氯化钠2g于200mL 蓝口玻璃瓶中，加入无菌水（电阻率＞18.2MΩ.cm）200mL。
2.1.2 121℃，20min高压蒸汽灭菌LB培养基。
2.1.3 待培养基冷却，超净工作台内加入氨苄西林钠100μL（浓度为0.2g/ml），接种PET32a-NdeI-hil4菌液20μL，37℃，220r/min摇床培养，过夜。
2.2 提取细菌基因组DNA(细菌基因组DNA提取试剂盒)2.2.1分别取细菌培养液1～5mL于标记A、B的离心管中（细菌提取量约为1.0×108个细胞），10000rpm,离心1分钟,尽量吸尽上清。
2.2.2 向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入4μLRNaseA(100mg/mL)溶液，目录号：RT405-11，振荡15s，室温放置5min.2.2.3 向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
2.2.4 加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min,简短离心去除管内壁水珠。
（注：加入缓冲液GB时可能产生白色沉淀，一般70℃放置10min会消失，不影响后续实验，如果溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可导致提取DNA量少和提取的DNA不纯。