RIA小结
1. 灵敏度高 2. 特异性好 3. 精确的定量 4. 方法操作简便
免疫放射分析法
（immunoradiometric assay,IRMA）
Ag + *Ab
Ag-*Ab + *Ab
（B） （F）
在体外, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性 复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。
• 加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。
• 孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是
37℃。 • 分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原－抗体复合物。 • 测量：测量游离或结合物部分的放射性。 • 数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。
基本方法
基本试剂
1.抗体
2.标记抗原
待测物质浓度与检测手段
超微量 微量
-6 10 mg/mL -3 10 mg/mL
常量
临床化学分析
-0 10 g/L
-12 10
pg/mL
-9 10
ng/mL
免疫分析
Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone
Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
Ag + *Ag + Ab
*AgAb + AgAb + *Ag
+ +
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
பைடு நூலகம்
B1% B2% B3% B4% B5% B6%
3.灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量
6.稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75
质量控制就是使用合适的方法以检查、 表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差， 并使这种误差降低到某一允许水平。
具体作用有：
1．检查误差的程度，决定测定结果的取舍。 2．识别误差的来源并消除其原因。 3．改进测定方法的设计以提高质量。
3．总放射性管（T） 反应后不分离就直接测得的 放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合 物和游离的标记抗原的总放射性。 4．标准管（B1~Bn） 放有不同浓度的标准抗原， 再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在 反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为 B 。 5．样品管（Bx） 用同剂量的样品代替标准管中 的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样 取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲 线上找到样品的浓度。
在体外条件下, 利用Ag与定量的 *Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，
Dr. Yalow
通过测定放射性复合物的量来计算出
Ag 量的一种超微量分析技术。
基本原理
*Ag + Ab + Ag
*Ag与Ag 免疫活性相同 *Ag＋Ag > Ab
*Ag-Ab + *Ag (F) (B)
Ag-Ab + Ag
受环境因素（温度、pH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。
质量控制（quality
control） 4.特异性（specificity） 交叉反应率 5.可靠性（validity） 平行性试验
A C B
1.精密度（precision） 变异系数（ CV ）7%~10% 2.准确度（accuracy） 回收率=测定值/真实值×100% 90%~110%
常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B 等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标 准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量 不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标
准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓
度变化而变化的函数关系。
标准曲线 左：横座标为等份刻度； 右：横座标为对数刻度
操作基本步骤
3.非标记标准抗原（标准品）
2.标记抗原
1）比活度和放化纯度足够高
比活度——每微克抗原 上标记放射性核素的千 贝可数（KBq/μg） 放化纯度——具有免疫 活性的标记抗原占总放 射性的百分数。 >90%
2）半衰期足够长 3）保持原有抗原的特性 大分子：125I 小分子：3H or 125I
3.非标记抗原 （标准品）
开创了医学生物学超微量分析方法
使人体内微量生物活性物质的测量成为可能
对现代医学的发展起到推动作用
• • •
1959 1960 1977
美国Yalow & Berson 英国 Ekin’s 获诺贝尔医学生物学奖
• R：放射性核素标记抗原
– 高灵敏（10 -9~ -15 g/ml） – 探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应) I：免疫学反应 高特异 以抗体为结合剂 B:标记抗原与非标记抗原竞争与同种抗体结 合
反应到达平衡慢 非特异结合主要影响高剂量区 低剂量区有不确定因素
B%
拟合的标准曲线
IRMA的标准曲线及 非特异结合曲线
拟合的NSB
B%
拟合的标准曲线
RIA的标准曲线及 非特异结合曲线
拟合的NSB
RIA
+
+
或
0
IRMA + 1
IRMA和RIA低剂量区的不确定因素示意图
1
非放射性标记免疫分析技术
酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术
Ab *Ag
分离B、F B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F)
R=B/F Ag
浓度 1 2 3 4 5 6
25
50 100 200 400 800
B%
标准曲线
B1% B2% B3% B4% B5% B6% B%
Ab *Ag
分离B、F
Ag
1
2
3
4
5
6
？
25
50 100 200 400 800
60
高纯度 化学结构、免疫活性与被测抗原相同
B和F的分离
1.第一类
双抗体沉淀法
PEG沉淀法
Ag
Ab(2)
Ab(1)
+
可沉淀复合物
可溶性复合物
2.第二类
试管
固相第二抗体法
试管
Ab(1)
Ab(2) Ag
分离方法的要求
分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗
原-抗体复合物解离或形成新的复合物。
酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，
用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正
比，而酶量又和复合物的量成正比。
常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四
甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代 替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能 形成激发态产物，并在退激时将能量转化为 光子的物质。
相结合的产物，是目前最先进的标记免疫测定技术 。
在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体
包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在
反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫
反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶
钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室， 同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时， 被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记 抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动
定 义
以放射核素标记（或其他非放射性标记）的 配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的 结合反应为基础，在试管内进行的微量生物 活性物质的检测技术。
体外分析技术是结合了放射性核素的高灵 敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微 量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密 度好、应用面广、方法简便等优点。
现代医学的发展 疾病诊断的革新
可在没有任何临床症状，而病人体内发生 1. 基因表达异常； 2. 受体分布异常或受体功能改变； 3. 器官代谢异常； 4. 激素水平异常 酶、神经递质 ……等异常， 可早期发现。 体外分析和影像学的发展起了很大作用 例如 癌症的早期诊断
放射免疫分析法的创立 集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫反 应的高特异性
B%
IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA 竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗原 三种主要反应试剂 所用抗体是限量的
*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关
IRMA 非竞争性抗原抗体结合反应 采用标记抗体 二种主要反应试剂 所用抗体是过量的 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关 反应到达平衡快 非特异结合主要影响低剂量区 低剂量区无不确定因素
电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进
行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原 的浓度成正比。
电化学发光免疫分析示意图
电化学发光免疫测定示意图
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图
反应时相－ 发光
ECL反应
TPA在电极表面氧化 释放一个电子形成激发 态的TPA阳离子 释放出一个质子 (H +) 形成激发态的TPA自由 基 (TPA*) 钌复合物也释放一个电 子 氧化形成激发态的3价 的三联吡啶钌 接着和激发态的TPA自 由基发生化学发光反应 发射出来的光短时间内 达到 峰值