酶法提取松针精油的实验室研究1刘晓庚，鞠兴荣，茆旭东，张珍(南京财经大学应用化学系江苏省粮油副产品深度利用重点实验室，江苏南京210003 )摘要：比较了水蒸气蒸馏法、微波法、酶法、微波辅助酶法和微波辅助离子液体酶法对新鲜松针提取精油的效果，并首次报道微波辅助离子液体酶法提取松针精油。
结果表明，微波辅助离子液体酶法的精油得率高达0.49 %~0.53 %，比最低的水蒸气蒸馏法提高48 %~67 %，比单用酶法提高了12.3 %以上；离子液体的回收率为98.5 %~100 %。
结论是酶法、微波辅助离子液体酶法和微波辅助酶法应用于松针精油提取是高效可行的。
酶法的最佳工艺条件是：温度50℃，pH值4.5，酶与松针的质量比1:500，酶解时间约1 h。
关键词：松针；精油；酶法提取；微波辅助离子液体酶法提取中国分类号：TQ351.014；Q814.9 文献标识码：ASTUDIES ON EXTRACTING ESSENTIAL OIL FROM PINE NEEDLE IN LAB LIU Xiao-geng，JU Xing-rong，MAO Xu-dong，ZHANG Zhen （Department of Applied Chemistry, Nanjiing University of Finance & Economics, Key Lab of Cereal & Oil’s By-products Utilization in Jiangsu province, Nanjing210003, China）Abstract：Five methods of extracting essential oil (natural perfume) from the fresh pine needles have been discussed, namely: enzymic (EZ) method, microwave-assisted (MA) method, steam distillation (SD) method,收稿日期：2004-02-11基金项目：江苏省教育厅自然科技资助项目（03KBJ550048）；南京财经大学预研究资助项目（0301）作者简介：刘晓庚（1962-），男，江西峡江人，教授，主要从事化学教学和科研工作；E-mail：lxg_6211@。
microwave-assisted enzymic (MAEZ) method, microwave-assisted ionic liquid enzymic (MAILEZ) method. The results showed that the essential oil yields from MAEZM was 0.49%-0.53%, or 12.3% higher than of single enzynolysis. The optimum conditions of EZ method were obtained by orthogonal experiment as follows: temperature 50℃, pH value 4.5, mass ratio of enzyme to pine needles 1:500, enzymic time 1 h. The recovery rate of ionic liquid was 98.5%~100%.Key words：pine needles；essential oil；enzymic extraction；microwave-assisted ionic liquid enzymic extraction松针中含有丰富的精油，其主要成分为萜醇、萜烯、醚、酮、酚和酚脂。
松针精油是从松树茎、叶等经提取、分馏而得的具有松针油特有的愉快香味的浅黄色或深黄色液体。
其应用广泛，除用作香料和合成香料的原料外，还用作树胶、树脂、油类、纤维素醚等的溶剂，矿物质的浮选剂，酒精的变性剂，消泡剂，湿润剂，杀菌剂以及纺织品的加工等[1]。
用酶法提取既保护了松针精油的有效成分在提取过程中不被破坏，又缩短了提取时间，提高了提取效益[2]；而微波和离子液体有激活和增强酶活性以及促进提取效率的作用[3~4]。
因此，本研究着重探讨了用酶法、微波辅助离子液体酶法和微波辅助酶法提取松针精油。
1 实验材料1.1主要仪器DS-1高效组织捣碎机；HH-4数显恒温水浴锅；WXG-4圆盘旋光仪；SHIMADZU UV-2401PC紫外分光光度计；WD900SL23-2格兰仕微波炉；阿贝折光仪。
1.2试剂材料纤维素酶：酶活力≥1 500 U/g，中国医药(集团)上海化学试剂公司；酶活力≥82 GCU/g，广东裕立宝公司提供，离子液体：咪唑系列的离子液体由中国科学院兰州化学物理研究所提供，胍盐类离子液体自制，其他试剂均为分析纯。
将采自南京财经大学校园和红山动物园新鲜松针用水清洗、除杂、晾置风干后，用刀切成长1~3 cm备用。
2 实验部分2.1提取基本原理纤维素酶（CE）又称β-1,4-葡聚糖水解酶，系黑曲霉（Aspergillus niger）或木霉菌（Trichoderma viride）培养发酵液中提取而精制的酶制剂。
它能使纤维素多糖中β-1,4-葡聚糖水解为β-糊精，其保存的最适pH值4.5 ~ 5.5，对热较稳定，即使在100℃保持10 min仍可保持原活性的20%以上，其最适温度50~60℃，天然存在于许多霉菌、细菌中[5]。
CE对植物具有专一分解特性，催化多糖类物质的水解，可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力，促进传质过程，使有效成分提取率提高。
微波能大幅度地提高传质和扩散速率，离子液体又有增强纤维和细胞壁的溶解度和提高酶活性等多重作用。
采用微波辅助离子液体CE酶法在较低温度下提取松针精油，在短时间内即可达到高效提取有效成分的效果[3~4,6]。
2.2 提取方法2.2.1 酶法提取取50~150 g新鲜切好的松针样品加入适量的水，捣碎5~10 min。
用HCl或Na2CO3调节pH值，加入按文献[2]方法活化的活性酶CE，于设定温度下进行酶解。
然后抽滤，滤液用有机溶剂萃取，真空蒸馏，回收溶剂，收集有浓郁香味浅黄色油状物，用无水硫酸钠干燥，即得松针精油。
2.2.2水蒸气蒸馏法先用水蒸气从新鲜松针样中提取粗精油[7]，然后萃取，分离，干燥。
2.2.3微波法将加水捣碎好的松针样于设定功率和时间下进行微波提取，再抽滤，萃取，分离，干燥。
2.2.4微波辅助酶法是在酶法提取中的酶解过程辅以微波。
2.2.5微波辅助离子液体酶法用离子液体代替水捣碎松针、微波辅助酶解和过滤后，加水分出离子液体，再蒸馏、干燥。
2.3精油的测定用常规方法测定精油的感观指标、相对密度、折光率和比旋光度等；用UV-2401PC紫外分光光度计测定UV吸收谱；用HP5988A GC-MS测定精油的组成等。
3结果与讨论3.1酶法提取的最佳条件从表1得到影响CE酶法提取松针精油的因素主次顺序为：CE用量(活性)>酶解温度>提取时间>酶解pH值。
酶法提取的最佳条件为：温度50℃，pH值4.5，酶与松针的质量比1:500，酶解时间约1 h。
与文献[2]的温度和pH值相近。
各因素对精油得率的影响如图1所示。
用计算法[8]得到佳条件下精油得率0.514 %，实验值0.502 %，二者相当吻合。
表 1 正交试验表Tab. 1 Results of orthogonal test序号№A酶解温度/℃enzymolysisBpH值pHCm酶: m松针m enzyme :D萃取次数E萃取剂extractantF酶解时间/henzymolysis提取率1）/%yieldtemperature value m pine needle extracttimestime1 40 4.0 1:300 3 乙醚ether 3 0.4692 50 4.0 1:400 2 乙醚ether 1 0.4763 60 4.0 1:500 1 乙醚ether 5 0.486 4405.01:4001乙醚ether 30.4545 50 5.0 1:500 3 石油醚petro-ether 1 0.4706 60 5.0 1:300 2 石油醚petro-ether 5 0.4737 40 4.5 1:500 2 石油醚petro-ether 3 0.4978 50 4.5 1:300 1 石油醚petro-ether 1 0.481 9 60 4.5 1:400 3 混合MS 2) 5 0.472 10 40 4.0 1:400 1 混合MS 3 0.465 11 50 5.0 1:500 3 混合MS 1 0.494 12 60 4.5 1:300 2 混合MS 5 0.463 K 1 3.770 3.786 3.771 3.807 3.764 3.781 Y 总=11.39 Y 均=0.475K 2 3.839 3.780 3.733 3.818 3.840 3.839 K 33.7813.8243.8863.7653.7863.770R0.069 0.044 0.1530.053 0.076 0.0691）两次试验结果的平均值average value of 2 test；2）两种溶剂的混合物mixed solvents3.2几种提取方法提取效果的比较5种方法的提取效果见表2。
从表2可见，精油得率以微波辅助离子液体酶法得率最高，比单用酶法和微波辅助法分别高0.02 % ~ 0.07 %和0.02 %~0.18 %。
但微波控温不易掌握，易造成温度过高而使纤维素酶失活，而用水浴等传统控温方式虽然得率稍低，但条件易控制，操作稳定。
用离子液体微波辅助酶法提取，不仅最大限度地保护了酶活性，而且分离简便，离子液体回收率和重复使用效果都很高，但离子液体成本相对高些。
其它几种方法溶剂的回收率也都较高。
表2 不同提取方法的提取效果比较Table 2 Comparison of the result of the different extracting methods方法methods 水蒸气蒸馏法SD method微波法MAmethod酶法EZmethod微波辅助酶法MAEZmethod微波辅助离子液体酶法MAILEZ method精油得率/%ethereal oilyield0.28~0.36 0.35~0.45 0.46~0.50 0.46~0.52 0.49~0.53溶剂回收率/%92.78 92.24 92.45 92.31 98.5~ 100solventrecovery3.3松针精油的测定分析经测定，5种方法提取的精油均是有浓郁松香气味的浅黄色透明液体，其相对密度、折光率和UV谱的测定结果也都一致，其中：d421=1.024~1.152 (20℃文献值[9] 0.896 2~1.188 0)，n D19=1.432 50~1.548 60 (20℃文献值[9] 1.430~1.610)；UV 结果显示精油的吸收峰在220和280 nm处，这表明精油中含有单不饱和双键和多共轭不饱和键体系的萜烯类化合物。