2013年第1期广东化工第40卷总第243期 · 65 · 微生物浸矿菌群的选育及培养彭阳，严国俊(东华理工大学，江西抚州 344000)[摘要]微生物浸矿技术是以湿法冶金和微生物学为基础的一门交叉学科，具有环境友好，反应温和，流程短，能耗低的优势。

但是由于在使用微生物浸矿时菌群易受到特殊毒害因素或环境条件的影响，从而降低矿石的浸出率。

因此在微生物浸矿技术中，针对性菌群的选育及培养技术占据了比较重要的地位。

文章对浸矿菌群的选育及培养的方法进行了综合性地介绍和评述。

[关键词]浸矿微生物；选育；培养[中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2013)01-0065-02Breeding and Culture of Microbial Leaching MicrofloraPeng Yang, Yan Guojun(East China Institute of Technology, Fuzhou 344000, China)Abstract: Microbial leaching technology is an interdisciplinary based on hydrometallurgy and microbiology with advantages of environment-friendly, mild reaction short process, and low power consumption. However, the leaching rate of the ore is reduced because the microbial leaching microflora is susceptible to the influence of special poison factors or environmental conditions. Therefore in microbial leaching technology, the breeding and culture of targeted microflora technology occupy a more important position. The paper comprehensely introduced the breeding and culture of leaching microflora.Keywords: bioleaching microorganisms；breeding；culture微生物浸矿技术是利用细菌或其代谢产物所引起的生物化学氧化过程对矿物进行的生物化学氧化等化学作用并从矿石中溶浸目的矿物的过程。

该技术反应温和，环境友好，能耗低，流程短。

在矿石的日益贫杂及环境问题日益突出的今天，微生物浸矿技术将是金属元素提取、环境保护及废物利用的有效手段。

由于很多矿石中含有某些特殊元素，如氟、砷、钼等元素，在用微生物浸矿技术时菌群易受到毒害影响从而降低矿石的浸出率，因此在微生物浸矿技术中，针对性菌群的选育及培养技术占据了比较重要的地位。

1 浸矿细菌的选育浸矿细菌的的常见选育方法主要包括菌种的筛选、驯化、诱变和基因工程等。

1.1 浸矿细菌菌种的筛选目前在浸矿过程中使用的菌种约有二十几种，但其中直接有效用于浸出的仅有数种，其它多为伴生种，起促进作用。

将这些菌种按温度划分，可分为中温菌种(mosophiles，温度为20~35 ℃)，如嗜硫杆菌(Thiobacillus)和微螺旋菌(Leptospirillum)；中等嗜高温菌种(mederate thermophiles，温度为40~55 ℃)，如硫杆菌(Sulfobacillus)；高温菌种(thermophiles，温度为55 ℃以上)，如硫化裂片菌属(Sulfolobus)[1]。

对于低品位硫化矿生物堆浸，由于含硫量极少，氧化能少，堆温低，因而中温菌种更有效；而对于高品位硫化精矿的生物槽浸，由于含硫量大，氧化能大，温度高，适于用嗜高温菌种[2]。

目前，人们所开发的天然菌种仅约占微生物种类总量的5 %，因此，有望通过广泛筛选，获得更多更高效的菌种。

1.2 浸矿细菌的驯化浸矿细菌在投入生产使用之前要进行驯化，使之适应浸矿过程中可能对细菌不利的工艺条件或对细菌具有毒害作用的物质成分。

对于高氟铀矿来说，有害的物质成分主要是氟，对于难浸出金精矿的细菌氧化工艺，不利于细菌生长的因素是矿浆的含固量和溶解的砷等物质。

细菌驯化的办法是逐渐提高不利因素的强度之后对细菌进行转移培养，在驯化过程中，那些对新环境不适应的细菌受到抑制被淘汰掉，而某些活力较强的细菌会通过变异等途径，转变成耐受性较强的细菌而存活下来，形成对新环境具有耐性的菌株。

比如培养细菌耐氟能力的方法是：首先在装有一定体积培养基的锥心瓶中加入较低浓度的氟离子，然后接种要驯化的菌进行培养，开始是菌不适应，要较长时间才能生长繁殖，待细菌适应了此浓度的含氟离子培养基后，再将它转移到含更高氟离子浓度的培养基中继续培养，使用目的矿物不断转代培养或增加有毒离子的转代培养。

刘亚洁等报道[3]氧化亚铁硫杆菌经过较高浓度含氟离子培养基长时间培养驯化后，筛选到的菌株可在含氟1148 g/L的溶浸液中一昼夜即可将5 g/L Fe2 +完全氧化。

吴为荣等报道[4]对T.t进行耐氟驯化试验经过多代接种驯化后，T.t的耐氟能力得到明显提高。

王清良等[5]报道采用经过初步驯化的细菌进行了细菌耐酸耐氟驯化培养试验，经驯化的细菌的耐酸浓度由30 g/L提高到80 g/L，耐氟浓度由100 mg/L提高到850 mg/L。

细菌对矿浆含固量的驯化也可采用类似的方法。

吴为荣等报导[6]的氧化硫硫杆菌对721矿铀矿石的适应性驯化中，经过15代驯化培养，细菌的耐氟能力达到350 mg/L，固液比可达1∶3。

1.3 浸矿细菌的诱变育种诱变育种利用自然突变原理，通过使用诱变剂人为地提高生物的突变频率，并对人们所需性状的正突变个体加以选择和利用。

对于浸矿细菌来说，大多突变研究仅限于为了选择一些有特性的菌株，或基因工程育种的原始材料，或为该菌的分子遗传学积累基本知识。

利用物理或化学的因素(如紫外线、亚硝基胍、微波等诱变剂) 处理微生物群体，促使少数个体细胞的遗传物质(主要是DNA) 的分子结构发生改变，使基因内部的碱基配对发生差错，从而引起微生物的遗传性状发生突变[7]。

根据应用的要求，可以从突变株中筛选出某些具有优良性状的菌株供科研和生产使用。

一般育种程序包括菌株的选择、菌悬液的制备、诱变处理和变异株的筛选。

目前在育种实践中应用较多的诱变剂有紫外线、微波、氮芥、乙基磺酸乙脂、N —甲基—N —硝基—N —亚硝基胍和N —甲基—N—亚硝基脲，后两种的诱变效果最好。

在处理方法上，往往将许多诱变剂同时使用，或一种诱变剂多次重复使用[8-9]。

目前这方面的报道较多，采用的诱变手段各异，均取得较好效果。

如徐晓军等报道了[10]经紫外线诱变的浸矿细菌对黄铜矿的浸出率比原始菌提高了46 %以上，到达浸出终点的时间也缩短了5~10 天。

李广悦等[11]以氧化亚铁硫杆菌作为出发菌，经紫外线诱变，考察不同诱变时间对氧化亚铁硫杆菌耐酸和耐氟性能的影响。

试验结果表明，经45~60 min的紫外线处理，菌株对酸的耐受性增强到pH为1.2，对氟离子的耐受性达到0.6 g/L。

1.4 浸矿细菌的基因工程育种来源不同的氧化亚铁硫杆菌菌株对于金属硫化矿物的浸出效果是不一样的，说明氧化亚铁硫杆菌具有复杂的遗传特性。

对氧化亚铁硫杆菌进行基因工程改良的研究己见较多报导，是今后浸矿细菌育种的一个重要方向。

但目前为止，国内外所有工作都是自养菌基因工程的前期探索。

其主要原因是研究这些自养菌困难程度很大：没有足够的可供筛选的带遗传标志的菌株材料；难以转化和表达外源的DNA--氧化亚铁硫杆菌基因能在大肠杆菌中表达(Homesetal，1983；Rawingseta，1983)，而重组子返回来却难在氧化亚铁硫杆菌中表达(Homes et al，1984；Rawingsetal，1984)；在传代过程中易丢失其性能；可供能量的基质有限，难以固体培养[12]。

在这方面，南华大学的潘文俊通过分子生物学技术，克隆抗氟基因flr-4，将其导入T.f1中，以期获得稳定遗传的抗氟基因工程菌。

最终构建了pJRD215-fir-4表达载体，通过接合转移将载体[收稿日期] 2012-11-25[作者简介] 彭阳(1987-)，女，平度人，硕士研究生，主要研究方向为溶浸水文地质。

广东化工 2013年第1期· 66 · 第40卷总第243期导入到氧化亚铁硫杆菌T.f中获得了遗传稳定的抗氟基因工程菌，T.f1基因工程菌的抗氟能力提高了200 %以上[13]。

2 浸矿细菌的培养2.1 浸矿细菌的培养基微生物从中吸取营养并赖以生存繁殖的介质称为培养基，主要分为液体和固体两种形式。

液体培养基用于粗略的分离培养某种微生物，而进行微生物的纯种分离则需要用固体培养基。

浸矿细菌的液体培养基是由水和溶解在其中的各种无机盐组成的，每种细菌都有自己特有的培养基配方，这些配方是经研究者的研究之后提出来的，例如氧化亚铁硫杆菌常用9K培养基，氧化硫硫杆菌常用Waksman培养基。

用作平板分离的固体培养基，是在上述液体培养基中加入1.5 %左右的琼脂或一定量的硅胶制成的。

首先在加热条件下配成一定浓度的琼脂溶液，用硫酸调节好酸度，将此溶液灭菌后再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，冷却至常温即制成固体培养基。

固体培养基常用来进行菌种的分离培养。

2.2 浸矿细菌的实验室培养浸矿细菌的实验室培养是很重要的一步，一方面可以通过实验室的传代培养提高浸矿细菌的活性，达到提高浸矿效率的目的。

另一方面可对浸矿细菌进行生理生化特性研究，探索细菌生长的最适条件以及对细菌进行分离纯化培养对菌种进行鉴定。

2.3 浸矿细菌的连续扩大培养把一定数量的细菌，接种于合适液体培养基中，在适宜温度下培养，细菌群体的生长过程具有一定规律性。

细菌的生长曲线，大致可划为4个阶段:调整期、对数期、平衡期、衰老期[14]，在对数生长期，群体细胞以指数速率增加，而且所分裂形成的细胞都是活的。

分批培养时，由于微生物在一个固定容积的反应器中生长，培养基中营养物质逐渐消耗，代谢产物逐渐积累，必然会使微生物的指数生长发生变化，生长速率降低。

为克服这种缺点，要采用连续培养，即在一个恒定容积的流动系统中培养。

一方面以一定速度不断地加人新的营养物；另一方面又以相同速度流出培养物(菌种和代谢产物)、这样便可使培养系统中细胞数量和营养状态保持恒定。