专论与综述 固定化酶制备方法研究进展曹树祥　黎苇(九江职业大学,九江332000)摘要　对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方法的优缺点进行了比较。

关键词　固定化酶　吸附　包埋　共价键结合　肽键结合　交联 本世纪60年代,一项新的技术——固定化酶技术开始发展起来。

最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物,称为“水不溶酶”或“固相酶”。

后来发现,也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。

将酶置于超滤装置中时,高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧,而反应物可以透过膜流出,在这种情况下,酶本身仍是可溶的,只不过被固定在一个很有限的空间内,因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。

1997年第1届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称。

从60年代起,固定化酶的研究迅速发展,固定化方法目前已超过200种以上。

近来研究较多且应用最广的两种方法分别为卡拉胶聚糖包埋法和海藻酸钙凝胶包埋法。

本文依据国内外有关文献及作者在这一领域的试验与体会就固定化酶的主要制备方法作简要介绍与评述。

1　固定化酶制备方法的分类固定化酶的制备方法可分为如下几类:(1)吸附法:物理吸附法、离子吸附法等。

(2)包埋法:聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。

(3)共价键结合法:重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇-二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等。

(4)肽键结合法:酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。

(5)交联法。

2　吸附法2.1　物理吸附法[1]使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。

常用的载体有:(1)有机载体,如面筋、淀粉等;(2)无机载体,如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。

用此法制成的固定化酶,活力损失少,但酶与载体的结合不牢固,易于脱落,很少有实用价值。

2.2　离子吸附法[1]此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合,酶吸附于载体上较为牢固。

此法在工业上应用较广泛,常用的载体有:(1)阴离子交换剂,如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等;(2)阳离子交换剂,如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-120、IR-200、Dowex-50等。

1999-01-12收到初稿,1999-05-30收到修改稿。

3　包埋法包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内,这种结构可以防止酶渗出,但是底物能渗入格子内与酶相接触。

此法的优点是适用范围广,许多种酶都可用此法固定,工艺简便,酶分子仅仅是被包埋起来,固定化过程中酶未参与化学反应,故可得到活力较高的固定化酶。

但是,用此法制成的固定化酶,不能对大分子底物的生化反应起催化作用。

3.1　聚丙烯酰胺凝胶包埋法此法是将含有游离酶的水溶液与丙烯酰胺溶液混合,在交联剂、引发剂等的作用下,丙烯酰胺聚合成凝胶,将酶包埋入凝胶格子,将所得凝胶作成颗粒,低温贮存或冷冻干燥成为粉末。

制备聚丙烯酰胺凝胶的具体方法是:将1ml酶溶液(酶溶于适当缓冲液中),加于含750mg丙烯酰胺单体和40mg N,N -甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中,再加入0.5ml 二甲氨基丙腈质量分数为5%的溶液作为加速剂,加入0.5ml过硫酸钾质量分数为1%的溶液作为引发剂。

将此混合物在23℃下反应10min,便成为含酶的凝胶。

凝胶的孔径为10～40~,将此固定化酶用于生化反应过程,底物和产物可通过凝胶格子进出,而酶分子则不能渗出。

3.2　辐射包埋法[2]酶溶解在纯单体水溶液、单体加聚合物水溶液或纯聚合物溶液中,在常温或低温下,用C 射线、x射线或电子束进行辐射,可以得到包埋有酶的亲水凝胶。

3.3　卡拉胶包埋法[3]卡拉胶(K-Carrageenan)是由角叉菜提取的一种多糖。

具体包埋方法是将100mg酶在37～50℃下溶于1mL蒸馏水中,另将1.7g卡拉胶在40～60℃下溶于34mL生理盐水中,将上述两种溶液混合,然后冷却至10℃,使凝胶形成并强化。

将凝胶浸在浓度为0.3mol/L的氯化钾溶液中硬化,将此硬化凝胶作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。

如将此固定化酶再用硬化剂如单宁、戊二醛或六甲叉二胺处理,便可得到更稳定的固定化酶。

此法条件温和,操作简单,可供多种酶固定化之用。

3.4　微囊法[4]此法是将酶包埋于半透性聚合体膜内或包埋于液膜内,形成直径为1～100L m的微囊。

微囊制备方法如下:(1)界面聚合法。

此法是将酶的水溶液和亲水单体用一种与水不混溶的有机溶剂作成乳化液。

再将溶于同一有机溶剂的疏水单体溶液,在搅拌下,加入上述乳化液中。

在乳化液中的水相和有机溶剂相之间的界面发生聚合作用形成半透膜,这样水相中的酶即被包埋于半透膜内。

(2)液体干燥法。

将一种聚合物溶于一种沸点低于水且与水不混溶的溶剂中,加入酶的水溶液,以油溶性表面活性剂为乳化剂,制成第一种乳化液。

把它分散于含有保护性胶质(如明胶)、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中,形成第二种乳化液。

在不断的搅拌、低温和真空条件下蒸出有机溶剂,便得到含酶的微囊。

常用的聚合物为乙基纤维素、聚苯乙烯、氯化橡胶等,常用的有机溶剂为苯、环己烷和氯仿。

(3)分相法。

将酶的水溶液分散于含有聚合物的与水不混溶的有机溶剂中,一边搅拌,一边加入另一种有机溶剂(它与前一种有机溶剂可混溶)。

此时聚合物浓缩,在微小水滴的周围形成薄膜。

上述两种有机溶剂都必须与水不混溶。

例如,聚合物为乙基纤维素时,第一种有机溶剂为四氯化碳,第二种为石油醚;聚合物为硝基纤维素时,第一种有机溶剂为乙醚,第二种为苯甲酸丁酯。

(4)液膜(脂质体)法。

上述微囊法是用半透膜包埋酶液,近年又研究出采用液膜的新微囊法。

例如,糖化酶的液膜固定化方法,是用由表面活性剂和卵磷脂制成的脂质体液膜来作微囊的。

此法的最大特征是,底物和产物穿过液膜时与膜的孔径无关,但与底物和产物在膜组分中的溶解度有关。

3.5　辅因子微囊法辅因子如与大分子以共价键结合,是不能留在聚酰胺膜微囊的。

Yu等[5]使用新的拟脂-聚酰胺膜微囊,使辅因子可以保持原样地留在微囊内。

此法可以制备固定化脲酶、谷氨酸脱氢酶、醇脱氢酶等。

4　共价键结合法共价键结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法,此法研究较为深入。

与载体以共价键结合的酶的功能团,包括:(1)氨基:赖氨酸的E-氨基和多肽键的N末端的A-NH2基;(2)羧基:天门冬氨酸的B-羧基、谷氨酸的A-羧基和末端A-羧基;(3)酚基:酪氨酸的酚环;(4)巯基:半脱氨酸的巯基;(5)羟基:丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基;(6)咪唑基:组氨酸的咪唑基;(7)吲哚基:色氨酸的吲哚基。

最常见的为氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳环。

此法的优点是,酶与载体的结合较为牢固,酶不易脱落,但因反应条件较为剧烈,酶活性有所降低,且制备过程较繁琐。

共价键结合法有以下几种:(1)重氮化法[6]。

此法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮化物通过共价键相连接而固定化。

含有氨基的载体先与亚硝酸反应生成重氮化合物,再与酶蛋白反应,使酶固定化。

常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺等。

(2)烷基化和芳基化法[4]。

以卤素为功能团的载体与酶蛋白的氨基与巯基发生烷基化或芳基化反应而成固定化酶。

此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。

卤乙酰衍生物包括氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素等。

(3)戊二醛处理法。

戊二醛与含有伯氨基的聚合物反应,可以生成具有醛功能的板模。

酶蛋白可与用戊二醛处理过的聚合物发生不可逆的结合,例如使用氨基乙基纤维素和戊二醛,可使胰蛋白酶等固定化[7]。

所用载体除氨基乙基纤维素外,也可用DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、部分脱乙酰壳质、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。

此外,还可将酶用物理吸附法吸附于多孔物质上,或用离子吸附法使酶与用聚乙烯亚胺处理的二氧化硅相结合后,再用戊二醛处理,使其成为固定化酶[8]。

(4)钛螯合法[9]。

Spheron是一种由羟乙基异丁烯酸酯和乙烯二异丁烯酸酯共聚而成的大孔亲水凝胶,带有很多羟基,可用钛螯合法供酶的固定。

钛盐无毒、无致癌性,价格低廉,且载体可以回收。

具体方法请参照文献[1]。

(5)硫醇-二硫化物互换反应法[10]。

聚合的二硫化物混合物可进行硫醇-二硫化物互换反应,产物可以与酶蛋白中的巯基进行可逆的偶联反应,并且只有巯基才能与之偶联,从而将酶蛋白固定在硫醇-二硫化物互换反应的产物——硫醇聚合物中。

(6)四组分缩合反应法[11]。

羧酸、亚胺、醛和异氰酸四组分的缩合反应可生成一种N-取代的酰胺。

选择适当的载体加入N-取代的酰胺,可使酶蛋白中的氨基和羧基直接相互偶联而固定化。

此法适用于固定对醛不敏感的酶。

5　肽键结合法这是在酶蛋白与水不溶性载体间形成肽键而被固定的方法。

此类方法包括以下几种。

5.1　用酰基迭氮衍生物固定化(1)将CM-纤维素酶转变为甲酯,再与肼作用,成为酰肼,此酰肼与亚硝酸作用成为相应的迭氮衍生物。

此衍生物在低温下与酶蛋白作用,使酶固定化[12]。

(2)聚甲基谷氨酸通过迭氮反应成为酰基迭氮衍生物,可用作脲酶和尿酸酶的载体制成固定化酶。

这些固定化酶可做成薄膜、球状、条状等,酶的活性可保留95%以上,且热稳定性高。

5.2　用溴化氰活化的多糖类固定化此法是将水不溶性多糖类、纤维素、交联右旋糖酐和琼脂糖用溴化氰活化后,供制备固定化酶用。

5.3　用碳酸纤维素衍生物固定化将纤维素粉悬浮于甲硫砜、二口恶烷和三乙胺混合溶剂中,并在0℃下加入氯甲酸酯,搅拌10min后,将反应液用浓盐酸中和,并移至乙醇中,制得活化纤维素。

将此活化纤维素加入溶有酶的中性缓冲液中,在5℃下缓缓搅拌4h,即得固定化酶。

5.4　用马来酐衍生物固定化马来酐与乙烯、苯乙烯等的共聚物可用于酶的固定化,例如,马来酐和乙烯共聚物在六甲叉二胺存在下与酶作用,则在马来酐与酶蛋白的氨基之间形成钛键,而得到固定化酶。

5.5　用异氰酸衍生物固定化将含有一个芳族氨基的载体在碱性条件下与光气反应,或将含有酰基迭氮衍生物的载体在加热下与盐酸反应,均可得到相应的异氰酸衍生物,所得异氰酸衍生物可供酶固定化用。

5.6　与硫酰胺结合固定化此法是使酶蛋白与载体的异硫氰酸衍生物之间形成硫酰胺键,再与酶反应而得到固定化酶。