红豆杉组织培养生产紫杉醇的研究进展李西齐哈尔滨工业大学（威海）山东威海生物工程系（07201）摘要：红豆杉是珍稀药用裸子植物,其内含物紫杉醇对癌症尤其是乳腺癌和卵巢癌有显著治疗效果,但其天然来源物种稀少,濒临灭绝。

实现工业化生产紫杉醇是解决紫杉醇药源需求的最佳途径。

利用红豆杉组织培养技术,在人工环境中对红豆杉组织细胞进行培养,筛选高产紫杉醇细胞系,可以实现大量、连续地生产目的产物紫杉醇。

红豆杉组织培养体系建立是组织培养技术生产紫杉醇中的关键,通过这个阶段对红豆杉组织器官培养,获得稳定生长、增殖的细胞,为筛选高产紫杉醇细胞系建立基础。

从上世纪七八十年代至今许多优秀的研究人员对这一课题进行了不断的探究和创新，在组织培养和提取方法上做了许多的优化。

本文综述了国内外红豆杉属植物组织培养研究方法和最新研究成果，以及紫杉醇生产方法的优化研究，为今后相关的研究和应用工作提供参考借鉴和帮助。

关键字：红豆杉紫杉醇组织培养优化综述引言红豆杉属植物为红豆杉科常绿乔木或灌木,分布于北半球温带至中亚热带地区,全世界共11种,即欧洲红豆杉(T.baccataL.)、短叶红豆杉(T.brevifolia Nutt.)、加拿大红豆杉(T.canadensisMarsh)、佛罗里达红豆杉(T.floridanaChapm.)、杂种紫杉(T.mediaRehd.)、球果红豆杉(T.globose),以及西藏红豆杉(T.wallichiana Zucc.)、东北红豆杉(T.cuspidataSieb.et Zucc.)、云南红豆杉(T.yunna-nensis Cheng et L.k.Fu)、红豆杉[T.chinensis(Pilg)Rehd.]和其变种南方红豆杉(T. chinensis var mairei),后5种在我国有所分布【1】。

而紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉科红豆杉属(Taxus spp.)植物中分离出的具有紫杉烷独特骨架的二萜类成分,由于它对转移性卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等癌症具有很好的疗效,正日益为人们所重视。

为了解决紫杉醇有限的药源问题,国内外学者围绕红豆杉植物的栽培、紫杉醇的化学合成(包括半合成和全合成)、红豆杉的组织和细胞培养等领域进行了有益的探索,取得了一些令人瞩目的进展。

在整个研究提取紫杉醇的过程中人们曾经尝试全合成、半合成、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等方法[2]。

其中细胞培养法由于具有下述优点成为人们：进行生产的优选方法:(l)能够确保产物无限、连续、均匀地生产,不易遭受病虫害、季节等因素的影响;(2)可以在生物反应器中进行大规模培养,并且通过控制环境条件提高紫杉醇产量;(3)所得产物比从植物体内直接提取简单,可以大大简化分离和纯化步骤;(4)除提供紫杉醇外,还可以生产出前体及其他有抗癌活性而原植物所不含的化合物。

本文将从红豆杉植物细胞组织培养整体方法选择、各阶段培养条件选择和优化、紫杉醇的生产提取方法及优化等方面对近三十年来的研究成果进行综述。

1.红豆杉组织培养方法选择红豆杉组织培养试验研究已开展了30多年,其方法主要分为四大类,即离体胚培养法、嫩芽增殖法、愈伤组织再生植株法及体细胞胚发生法。

根据师春娟等的研究比较发现目前最常用的组织培养方法为愈伤组织再生植株法，同一条件下此种方法诱发率和成活率也较高于其他方法【3】，由于之后紫杉醇的生产多用到细胞悬浮培养，所以关于愈伤组织培养法的条件改良方法也比较多。

2.组织培养条件的选择和优化2.1外植体的选择和预处理由于紫杉醇只存在于红豆杉的树皮当中，含量极其稀少，所以组织培养过程中应当选择紫杉醇含量较高的外植体进行组织培养。

目前,在关于红豆杉属植物组织和细胞培养的文献中,被用来作为诱导红豆杉愈伤组织外植体的有针叶、幼茎、树皮、形成层、种子及假种皮等,大多都是采用1～2年生枝条、叶和幼嫩茎段。

以幼茎、形成层或树皮诱导伤组织的效果最好,诱导率亦高,其它的外植体诱导能力较差,或根本诱导不出愈伤组织。

杨礼香等发现,以芽作为外植体,可以解决由于茎段外植体污染率高的困难,而且由芽诱导的愈伤组织生长速度较快。

Fett-Neto等、Christen等的研究表明,不同种属应优选不同的组织作为外植体【4】。

但目前根据我国研究人员的研究对象而言多为南方红豆杉和东北红豆杉，针对这两种红豆杉的组织培养现状，选择当年生嫩茎作为外植体的效果最好。

由于选择的外植体本身直接诱导形成愈伤组织要突破其生理限界，而且进行接种前的消毒也是必要的。

所以预先对外植体进行消毒处理在研究人员当中已成共识。

李健等经过正交实验确定出的最佳消毒方案为先使用70%的酒精浸泡30s,再使用0.2%的升汞浸泡8min【5】。

而根据秦宇等人的进一步研究发现消毒剂类别及消毒时长对红豆杉愈伤组织诱导存在影响,单独使用0.1%升汞消毒12min对外植体消毒时,污染率最低,愈伤组织诱导率为100%联合使用两种低浓度消毒剂对材料进行消毒,0.1%氯化汞+300mg·L-1抗生素分别使用6min、20min 消毒效果最佳,愈伤组织诱导率为100%。

对生长环境复杂的组织材料可选用联合使用两种消毒剂对组织材料消毒从而降低污染率,对表面较为洁净、生长环境简单的材料可选择使用一种消毒剂对材料进行消毒【6】。

综合几种预处理方法，我们发现随着研究的深入和不断的创新消毒方法也趋向于多元化，更多地向无机试剂与生物制剂的联合使用发展。

2.2愈伤组织诱导2.2.1培养基的选择和愈伤组织诱导综合红豆杉的组织培养和提高紫杉醇的产率以及方便其提取等几个方面的要求考虑培养基和愈伤组织诱导方法的的选择和优化应该是整个过程中最关键的步骤。

这也是研究人员们不断尝试和创新的节点。

秦宇等人对红豆杉愈伤组织诱导、增殖阶段培养基类型及成分、组织细胞培养环境进行了筛选,试验结果证明红豆杉愈伤组织诱导最佳培养基及培养条件为：改良B5+TDZ0.002+NAA1.0+2,4-D10+100mg·L-1抗坏血酸,pH=6,温度25℃,避光培养；红豆杉组织细胞增殖最佳培养基为：改良B5+TDZ0.002+NAA0.5+2,4-D0.5+300mg·L-1抗坏血酸,pH=6,环境温度为25℃,避光培养。

【7】由于红豆杉的组织培养更多的是为了增大紫杉醇的产量，所以根据提高紫杉醇产率和方便提取等要求Cino等人认为用液体培养基可以缩短从诱导到悬浮培养的生产周期【8】，用液体培养基诱导愈伤组织的主要优点在于：可以将组织培养的愈伤组织直接转化为悬浮培养避免了从固体到液体悬浮的适应性问题，提高了成活率缩短了生产周期。

但是从他的实验结果看来经三周悬浮培养后的紫杉醇的产量仅有0.01-0.02mg/L。

我国学者对于液体培养也进行了一定的改良，翟雪霞和李友勇采用纸桥法【9】在液体培养基上放置滤纸作为愈伤组织的载体有效地提高了诱导率和产率，但是效果并没有达到预期目标。

可见液体培养基诱导愈伤组织进行紫杉醇生产的方案还有待进一步改进。

所以目前为止最为常用的培养基仍为固体培养基，常规诱导的最佳条件为：20-25摄氏度，避光，培养基灭菌前pH5.5-6.0。

还有许多学者对培养基的成分进行了其他的改良，冯莹采用低氮的培养基有效地促进了诱导和提高了紫杉醇产率【10】。

许多学者在愈伤组织的诱导过程中尝试加入诱导子来提高诱导率和紫杉醇的产率，经过正交试验，翟雪霞和李友勇发现向培养基中加入D-苯丙氨酸可以较大幅度提高紫杉醇含量【11】，主要是因为苯丙氨酸的分子结构直接参与了紫杉醇侧链合成还可能是因为添加苯丙氨酸能形成一种有利于紫杉醇合成启动的诱导因素促进了细胞代谢合成因而提高了紫杉醇产量，李家儒等通过向培养基中尤其是在悬浮培养时加入Cu离子可以很大幅度的提高紫杉醇的产率【12】，这是因为在紫杉醇合成过程中铜离子可以有效促进其前体物质的合成，而且铜离子参与促进红豆杉愈伤组织细胞合成紫杉醇的代谢。

愈伤组织的诱导在红豆杉组织培养和紫杉醇生产过程中的地位是不言而喻的。

其改良方法也多种多样，但在改良的过程当中其目的却始终是提高诱导率和产率。

综合前人的研究我们发现培养基的改良正向着这样一个方向发展，那就是人们越来越将在紫杉醇合成过程中所需的必需前体物质或代谢调节物质加入其中，也正在不断地突破常规思路来改进培养基的物理化学性质和形态以便更好地实现其向工业生产的转化。

2.2.2愈伤组织的继代培养继代培养是有效扩大组织培养规模所必需的环节，合理地继代也是有效提高后期紫杉醇质量和产率的手段。

研究表明正常良好的愈伤组织形态为颜色呈黄色、淡黄色,细胞较为蓬松,呈沙粒状的细胞其可继代率较高,单位时间内细胞鲜重增加多【13】。

但是红豆杉细胞在培养时易出现褐化的问题，会很大程度的阻碍其细胞的生长和增值【14】，对此李健等对培养过程中的抗褐变剂进行了筛选，采取正交设计确定出抗褐变剂添加方案为PA浓度100mg/L,AC 浓度500mg/L,水解酪蛋白浓度6.0g/L【15】。

并且其实验表明在改良过的培养基中加入抗褐变剂培养32天的愈伤组织为最佳采收期，紫杉醇产量比原植物中高出4.73倍。

由此可见抗褐变剂的使用在组织培养和提高紫杉醇产率方面有着广阔的前景。

3.红豆杉细胞的悬浮培养和高产细胞系的筛选由愈伤组织制备成悬浮细胞是常用生产紫杉醇的方法手段，但如果使用液体培养基可省去这一步骤也可大大节省成本。

已有许多文献报道成功地建立了红豆杉属植物的悬浮培养细胞系,在培养过程中它们均可向培养基中不断分泌紫杉醇等次生代谢物。

据Edgington报道,用短叶红豆杉的树皮或形成层组织诱导的愈伤组织建立了一种高产细胞系，他将愈伤组织在锥形瓶中进行悬浮培养时,能分泌紫杉醇及其它一些化合物到培养基中,其产量可达1.0一3.om g/L,相当于209干树皮的含量。

而在国内李家儒等首次报道了红豆杉单细胞克隆的建立过程。

用悬浮培养10-15天的细胞培养物分离单细胞,采用看护培养技术成功地建立起单细胞克隆,这为筛选纯合稳定的红豆杉高产细胞系奠定了技术基础。

筛选高产细胞系的方法有很多，文献现实的方法基本为：前体饲喂、诱导子诱导、原位提取等，当让也有人进行了改变但大同小异没有实质性地改变。

值得关注的是目前研究人员正在采用基因工程手段对红豆杉基因进行改造来生产高产细胞系，我相信这将是紫杉醇生产未来的方向。

后记紫杉醇作为从红豆杉属植物的树皮和枝叶中分离出来的对卵巢癌和乳腺癌有特殊疗效的抗肿瘤药物。

其应用前景广阔必将为人类的肿瘤治疗研究作出重大贡献。

为了解决紫杉醇来源稀少产量低下的问题保护日益稀少的红豆杉资源，研究人进行广泛的研究和创新。

在红豆杉组织培养制备紫杉醇的过程中，目前大规模生产面临许多问题，仍是没有实质进展的研究课题。