• T+C反应：肼（低盐） • C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
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二、以使用DNA聚合酶为基础--DNA链末端终止法 基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被 测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终 止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补 链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的 DNA小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基 顺序。
主要步骤包括：末端终止法合成不同长度 DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析。
Sanger法发展过程
1977年sanger发明末端终止法
“加减法”
Sanger双脱氧终止法 DNA酶法测序 DNA自动测序仪
1、“加减法”测定DNA序列的原理
☺ 以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个适当的引
物（一般用限制性内切酶解片段），再加入4种脱氧三 磷酸（dNTP)为底物，其中一种用放射性同位素32P标记 （例如32PdATP) ,再加入DNA聚合酶IKlenow片断；
荧光检测探头
ddNTPs参与下的DNA复制
Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP： dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；
“标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记
反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反
应的ddNTP:dNTP来调整。
第二步 荧光检测
• DNA 带负电 • DNA在电泳胶中 的迁移率与其片段 大小有关
核酶的研究中的两个问题
• 核酶催化效率太低 • 由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解 酶(RNase)所破坏 • 因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或 作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究 工作。
◆ DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用
限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的
小片段（300-500bp)；
◆ PCR技术扩增DNA片段：DNA片段数量少的情
况下，以获取一定数量用于序列测定。
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核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
经典方法 化学降解法 (Maxam-Gillbert法,1977)
第五节 核酸的催化性质
The catalytic properties of nucleic acids
核酶（Ribozyme）
• 核酶的发现 • 核酶的催化性质 • 核酶的研究中的两个问题
核酶的发现
• Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能， 而RNA部分在有足够浓度Mg2+ 离子存在下，能起 核酸水解酶的作用。 • Cech发现RNA原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种 具有自催化性能的核酶。
分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱
氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射 出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依
此确定DNA碱基的排列顺序。
第一步 加入复制终止剂
谁电 跑泳 得， 快看
基本原理：
☺ 直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂； ☺ 将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为 模板，需要引物 、 DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用
32P/35S标记)
、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三
磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂) ；
☺ 在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP 后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，
使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的 四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。
☺ 四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离
开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测 DNA的核苷酸序列,如下图所示：
DNA酶法测序
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列
• DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)
• RNA酶 (ribonuclease, RNase) 依据切割部位不同分类 • 核酸内切酶： 限制性核酸内切酶
非特异性核酸内切酶
• 核酸外切酶： 5´→3´或3´→5´核酸外切酶。
核酸酶的功能
生物体内的核酸酶负责催化细胞内外核酸的降解
第三章 核酸
Nucleic Acid
王骊丽
第四节
核酸碱基序列顺序分析
(Sequence analysis of nucleic acids)
DNA碱基顺序的测定 RNA碱基顺序的测定
DNA 碱基顺序测定的基本步骤
DNA 片断的制备 DNA碱基顺序测定
DNA 片断的制备
由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子切割 或能够用于测定的小片段，共包括部分：
3）八聚体测序技术
4）转录测序
5）质谱法
6）原子探针显微镜 7）流动式单分子荧光检测法 8）芯片测序
核酸碱基顺序测定
• 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料， 经水解，测定核苷酸组成及比例；
• 先以外切酶确定5′- 或3′-末端核苷酸，再以内切酶 将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸 组成、比例和序列； • 最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个 核酸分子的核苷酸序列。
反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始
DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。
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3、DNA酶法测序
☺ 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同
的引物以及四种脱氧核苷酸；
☺在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，
条件下，只C断裂，而不与T反应。 • 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同 组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。
特异性碱基化学切割反应(2)
• G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。
• G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌 呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。
DNA自动测序结果
RNA 碱基顺序测定方法
• RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；
• 逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶 纯化下，合成DNA(与RNA互补的DNA分子，常 用cDNA 表示)； • 用化学降解法 或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺 序，再得出RNA的碱基顺序。
应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上 的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。
• 证明了核酸既是信息分子，又是功能分子
核 酶
催化性RNA (ribozyme) • 序列特异性的核酸内切酶 • 参与RNA转录后加工修饰 • 作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。
催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧 核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
核酶的催化性质
• RNA作用于RNA • 核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限 制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转 核苷酰反应等。 • 最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多 糖、DNA以及氨基酸酯等。
核酶的催化过程图
转 酯 作 用
转 酯 作 用
核酸酶是指所有可以水解)
• 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解， 分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷
和N7-甲基鸟嘌呤核苷；
• 肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞 嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存
在下水解，核糖腙3´-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐
☺ 从引物3′端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记的
dDNA 链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各 种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反 应混合物中多余的4种dNTP,将纯化后的混合物分成两份， 分别进行加减法反应系统。
脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构
少一个－OH
*
2、双脱氧链终止法
– Michael P. Robertson and William G. Scott Science 16 March 2007: 1549-1553. A SYNTHETIC RIBOZYME CATALYZES THE BOND FORMATION NECESSARY FOR RNA SYNTHESIS BY TRANSITION-STATE STABILIZATION AND ACID-BASE CATALYSIS, PERHAPS AS IN AN EARLY RNA WORLD. Abstract » Full Text » PDF » Supporting | | | Online Material » |
杂 交 测 序
分析化学的新发展
一、化学正在向生命科学领域渗透。
二、DNA 测序的研究工作, 历经了数十年, 成绩辉 煌, 曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作 是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家 更大的创造力！
正在发展的几种测序方法
1）毛细管电泳激光荧光法 2）超薄层板电泳激光荧光法
双脱氧链终止法 (sanger法,1977)
杂交测序法
新技术方法
质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA 芯片法
一、以化学裂解反应为基础—化学降解法
基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断
核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得
到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离； 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显 影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物 DNA小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。