固定：涂片干燥后，放入甲醇中固定10 min。取出晾干。 染色：将涂片于1%伊红染液中染色1 h，然后用蒸馏水轻
轻冲洗，晾干。
标本制备
颈椎脱臼处死小鼠
取双侧附睾， 纵向剪开被膜
+ NS 1ml，静置5min 轻摇，剔除大的组织, 收集悬液于1.5ml EP 管，加300 µl NS清洗
1000 rpm离心5 min 弃上清, 余0.15 ml液体
将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行 比较。 阳性的判断标准是畸形发生率至少为阴性对照组 的倍量或经统计学处理有显著性差异，并存在剂量-反应 关系者。
一般正常小鼠的精子畸形率为0.8%~3.4%
结果分析
分别计算各剂量组的精子畸形发生率。各剂量组的精子畸 形率与阴性对照组之间的差异分析采用秩和检验。
精子畸形发生率和畸形类型分析
试验报告
(1)受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂； (2)动物种属和品系、体重、数量、来源（注明合格证号
和动物级别）； (3)实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度
、实验动物室合格证号； (4)剂量分组，染毒途径和方式； (5)试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法； (6)结果：以列表方式报告受试物对动物精子畸形发生率
有条件时，可于给受试物后第1、4和10周处死动物，检查 精子形态 (各种致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种 致突变物后不同时间出现精子畸形)
动物染毒情况记录
操作步骤
标本制备
制片：用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分 离两侧附睾，放入盛有1 mL 生理盐水(37℃预热)的平皿中 。用眼科剪剖开附睾组织，室温下静置5 min ，轻轻摇动 ，用镊子将大的组织块挑出；收集悬液于1.5 mL 离心管 中；另取300 µL生理盐水冲洗平皿，收集于同一离心管中 ；1000 rpm离心5 min；弃上清，余约0.15 mL液体，吹打 混匀，常规涂片；
精子畸形的类型
精子 畸 形 ，主要表现在头部，其次为尾部。 可分为：无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、
双尾等。
操作步骤
阅片注意事项
无尾精子、头部重叠的或整个与另一个重叠的精子均不计 数。
判断双头、双尾精子时，要注意与两条精子的部分重叠相 区别。
数据处理和结果判断
每只动物应按精子畸形类型分别记录，以便计算各实验组 的精子畸形发生率和精子畸形类型的构成比。 利用 Wilcoxon秩和检验法和其他适当的统计学方法。
可检测环境Leabharlann 子对精子生成、发育的影响，而且对已知的 生殖细胞致突变物有高度敏感性，故本试验可用作检测环 境因子在体内对生殖细胞的致突变作用。
化学毒物 → 精子畸形率 → 生殖毒性、生殖细胞潜在致突变性
实验动物
成年雄性小鼠，6～8周龄、体重 25 g~35 g
剂量及分组
受试物设三个剂量组： 最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别 动物出现死亡的剂量，一般取1/2 LD50 低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4和1/8 LD50作为中、 低剂量
▪ 缺血、感染、发热等可产生假阳性结果。
结果分析
出现可重复的剂量反应关系时，可判断试验结果为阳性。 但要判定某一化学毒物为精子畸形诱变剂，至少应该有两 个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组显著增高 （P<0.01）；或达到阴性对照组的2倍或2倍以上，并且试 验结果能够重复。如果试验组的染毒剂量已使动物发生死 亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为阴性。 在受试化学毒物的毒性作用较低而不至于引起动物死亡时， 应当记录最大的染毒剂量。
混匀 涂片
阅片 1%伊红染色1 hr 甲醇固定10 min
操作步骤
阅片
在 低 倍 镜下找到背景清晰、精子重叠较少的部位，用高 倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整精子。
精子有头无尾(轮廓不清)或头部与其他精子或碎片重叠， 或明显是人为剪碎者，均不计算，每只动物至少检查1000 个精子。
操作步骤
同时设 阴性对照组(溶剂对照) 阳性对照组(环磷酰胺、丝裂霉素C，等)
每组至少有5只存活动物。
操作步骤
实验动物的处理
经口灌胃染毒，连续５天，每天一次。 (环磷酰胺120 mg/kg，蒸馏水，按体重的2%给予)
首次给受试物后的第35天处死 (大部分化学致突变物对精原细胞后期或初级精母细胞早期 的生殖细胞较敏感)
和精子畸形类型分析的结果(表1和表2）； (7)结论。
注意事项
▪ 辨别小鼠附睾； ▪ 如将精子悬液经过滤、离心等步骤除去组织残渣后再推
片效果更好，注意推片的质量；
▪ 镜检时注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。 ▪ 处于精母细胞阶段的生精细胞对诱变剂较敏感，因此在
染毒后3～5周时精子畸形率最高，必要时可作动态观察 有助于全面评价；
小鼠精子畸形试验
(Mice sperm abnormality test)
实验目的
精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物 精子正常形态的实验方法。
通过实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步 骤。
实验原理
精子畸形主要指精子形态的异常改变，是决定精子形成的 基因发生突变的结果。→ 形态改变提示有关基因及其蛋白 质产物的改变。