荧光法测定大鼠脑组织和血液中单胺类物质的方法探讨：1、主要仪器：荧光分光光度计（日本产，SHIMADZU RF-5301 PC）；组织高速分散器（上海产，XHF-1）；冷冻离心机（上海产，TGL-16G）；恒温水浴箱；旋涡混合器等。
2、试剂：剂来源除标明外均为国产分析纯级，试剂配制使用双蒸水。
（1）标准品：重酒石酸去甲肾上腺素；盐酸多巴胺；5-羟色胺硫酸肌酐；5-羟吲哚乙酸为瑞士Fluka产品。
（2）混合标准储存液的配制：分别精确称取上述标准品各 50mg，用 0.01N 盐酸配制成 100 ml 混合标准储存液（500ug/ml），置4℃冰箱保存，临用前稀释成1.25ug/ml应用液。
（3）酸性正丁醇：每升正丁醇加入浓盐酸0.85ml，混匀。
（4）正庚烷。
（5）0.1% OPT-10N 盐酸溶液：邻苯二甲醛为瑞士 Fluka 产品，临用前用 10N 盐酸稀释成0.001% OPT-10N盐酸溶液。
（6）0.25%半胱氨酸溶液：用0.1N盐酸新鲜配制。
（7）碘试剂：配制0.02N碘液和5%碘化钠（以70%乙醇溶解），临用前以1∶1体积比混合。
（8） 1/15 M ，PH=7.2的磷酸盐缓冲液。
（9） 0.33M碳酸氢钠溶液。
（10）碱性亚硫酸钠溶液：25%亚硫酸钠与5N氢氧化钠在临用前以1∶9体积比混合。
（11）0.1M EDTA 试剂：用1M醋酸钠溶液配制，以10N氢氧化钠调节pH至7.0。
3、实验方法：⑴标本处理：大鼠断头处死，立即取血及脑组织。
脑组织用冰生理盐水冲洗，去除血膜、嗅球和小脑，沿脑中线剖开，取一半脑组织吸干水分称重，加入10倍体积的冰酸性正丁醇，用组织分散器匀浆备用。
血液静置凝固后用冷冻离心机分离血清，立即加入10倍体积冰酸性正丁醇摇匀。
⑵提取过程：同时制备标准管和空白管，与血、脑标本在相同条件下按下图流程进行提取，获得水相A和水相B。
⑶NE、DA的测定步骤：各管取水相A 0.5ml，按下列流程进行操作：①水相A 0.5ml＋1/15M 磷酸盐缓冲液 1.5ml＋0.1M EDTA 0.4ml＋碘液0.2ml②混匀、静置 3min＋碱性磷酸钠（新配）0.4ml③混匀、静置 3min+5N 醋酸 0.4ml④混匀，80℃水浴，冷却⑤测NE荧光测度，激发波长为 382/488⑥继续沸水浴 20min，冷却⑦测DA荧光测度，激发波长 325/385。
⑷5-HT的测定步骤：各管取水相A 0.4ml，按以下流程操作：①水相 A 0.4ml+0.25%半胱氨酸（新配）0.1 ml+0.002% OPT-10N Hcl 3ml②混匀，沸水浴 10min，冷却③测各管 5-HT 荧光强度，激发波长为 360/480。
⑸5-HIAA的测定步骤：各管取水相B 0.5 ml，按以下流程操作：①水相B 0.4 ml+0.25%半胱氨酸（新配）0.1 ml+0.002% OPT-10N Hcl 2.5ml②混匀，沸水浴 10min，冷却③测各管 5-HIAA 荧光强度，激发波长 360/480。
复合营养素对认知与运动功能损伤大鼠的干预作用及其机制研究：脑组织单胺类神经递质—去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量的检测：①称取一定重量的脑组织，在冰浴条件下与预冷的酸化正丁醇以1：10的比例匀浆后，补足液体至4mL，旋涡振荡5min，以3000r／min离心5min，取上清液2.5mL置于反应管内，加入正庚烷5.OmL，0.1mol／L盐酸5.OmL，旋涡振荡5min，以3000r／min离心5min，其水相内含有NE、DA、5-HT。
②NE、DA含量的测定：取水相0.5mL，加入70mmol／L、pH7.2 PBS 1.7ml，碘试剂0.1mL，静置2min，加入碱性亚硫酸钠溶液0.5mL，静置2min，加入6mol／L乙酸溶液0.6mL，煮沸20 min，冷水冷却，用荧光分光光度计在475nm激发光，385nm发射光处测定NE的荧光强度；在370nm激发光，322nm发射光处测定DA的荧光强度。
③5-HT含量的测定：取水相0.5mL，加入5 g／L半胱氨酸0.1mL，40mg／L邻苯二甲醛3mL，煮沸lOmin，冷水冷却，用荧光分光光度计在475nm激发光，350nm发射光处测定5-HT 的荧光强度。
大鼠海马齿状回长时程增强(LTP)的检测：实验器材：金属电极，立体定位仪，生物电放大器，电刺激器，记忆示波器，计算机，生物数据采样处理软件。
实验步骤：(1)定位：按1.5 g／kg BW剂量给实验大鼠腹腔注射20％乌拉坦，麻醉后，立体定位仪上固定头部。
实施外科手术暴露头顶面颅骨，调节水平。
用牙科钻按记录电极(前囟后3.5mm、中缝旁2.Omm)和刺激电极(前囟后8.Omm、中缝旁4.Omm)的位置，同侧各钻开直径约为lmm的小孔，以各植入电极。
记录电极和刺激电极的参考电极及地线均与颅顶术面皮肉连接。
实验中采用不锈钢针单电极刺激、单电极胞外记录的方法。
电极直径0.35mm，外覆绝缘层，尖端裸露。
记录电极定位于大鼠海马齿状回(DG)颗粒细胞层(前囟后 3.5mm、中缝旁2.Omm、硬脑膜下3.5mm)，刺激电极定位于同侧的穿行通路(PP)上(前囟后8.Omm、中缝旁4.Omm、硬脑膜下3.Omm)。
(2)诱发群峰电位：实验开始时，用中等电流强度的单刺激(间隔30s，持续0.1ms)诱发DG产生群峰电位(population spike，PS)，记录30～60min。
待Ps幅度稳定后，上调刺激电流，使PS达最大；再下调刺激电流，使PS保持在最大峰值的50％，固定此刺激电流，记录每5min内PS幅值的平均值，共记录30min。
(3)诱发LTP：用高频刺激(high frequency stimulation，HFS)即2s内10次，间隔5ms，持续0.1ms，5个串的复合串刺激诱发LTP。
之后，恢复用强直刺激前的单刺激方式，记录PS幅度60min。
数据处理：PS幅度记录的是每5min内的平均值，以强直刺激前5min或30min内PS幅度的均值为100％，强直刺激前后各时间点记录的PS均值与之比较，以百分数表示。
强直刺激后PS幅度增大到130％以上，并可维持一定时间，一般认为是LTP。
PS的变化与突触可塑性密切相关，它主要体现了突触传递的效能和突触后神经元的兴奋性。
大鼠脑内单胺类神经递质的测定：①单胺类神经递质的分离：将大鼠迅速断头、取脑,立即放入冰箱内冷冻。
测定前,将速冻后的大脑组织取出,在冰上操作,将所需组织分离、称重,放入预先冰冻的玻璃试管中,后匀浆肾上腺素(NA)和多巴胺(DA)及5-羟色胺(5-HT)的分离。
②碘试剂氧化法测定 NA 和 DA：NA 和 DA 在一定条件下,与氧化剂碘试剂反应,生成三羟基吲哚化合物,具有荧光,其强度与浓度在一定范围内呈线形关系。
③OPT缩合法测定 5-HT：5-HT可在酸性条件下(HCL 不少于8mol/L)与OPT缩合,形成具有荧光的化合物。
脑组织内单胺类神经递质含量的测定：实验动物断头处死，迅速取出全脑称质量后置于冰盘上，准确称取0.5g脑组织加入预冷酸性正丁醇溶液5.0mL，在冰浴中置于玻璃匀浆器内制备组织匀浆。
振荡，离心取上清液待测。
通过荧光分光光度法测定脑组织内单胺类神经递质含量，分别在480nm/385nm(发射波长/激发波长)处测定去甲肾上腺素(NE)的荧光强度、375nm/325nm处测定多巴胺(DA)的荧光强度。
式中：a 为样品管荧光读数；b 为空白管荧光读数；c 为内标管荧光读数；m1 为所加标准品质量(NE 和DA 均为400ng)；m2 为组织湿质量/g；V1 为提取所用正丁醇体积(5.0mL)；V2 为测定所用正丁醇体积/mL。
检测方法：各实验动物给药6 w后，取动物脑组织，称重后于冰冷酸性正丁醇中制成匀浆，离心分离水相及有机相，5-HT，5-HIAA从在碱性条件下与邻苯二甲醛缩合，形成具有荧光的化合物，NE，DA与氧化剂反应成具有荧光的化合物，上述荧光化合物强度与浓度呈直线关系，即可测定其荧光强度。
神经行为试验结束后，各组随机抽取仔鼠 10只，断头取脑，去除血膜，切取中脑脑段，先置入小坩锅内用液氮处理1 min，后转至含有少量预冷的酸化正丁醇匀浆器中，冰浴中制成匀浆，离心，取上清液采用荧光分光光度计法测定脑匀浆中的NE、DA和 5-HT含量。
高效液相色谱-荧光法测定小鼠脑组织中的单胺类神经递质反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，㈠色谱条件：固定相分析柱为Lichrospher C185μm)，流动相组成A为甲醇，B为20.0 mmol/L柠檬酸三钠缓冲液(用盐酸调节pH为5.0 mmol/L，经0.45μm的滤膜过滤)。
梯度程序见表1。
在线氦气脱气，流速为1.0 ml/min，柱温保持在35℃，进样量20μL，荧光检测器波长设置为：激发波长280 nm，发射波长315 nm；以峰面积定量。
㈡标准品和脑匀浆样品的制备与测定：标准品分别用2.0％的高氯酸配成浓度为1 g／L的标准储备液，贮存于一20℃冰箱内，分析时按需要用2.0％高氯酸稀释成各种浓度的标准液。
测定标准曲线，NE、DA、5-HT在1.0～1000.0μg/L之间设定8个浓度系列，取20.0％进样，以峰面积对浓度绘制标准曲线，确定线性范围。
脑匀浆样品的制备：小鼠直接断头，在冰台上剥离出小鼠全脑(保留大脑及间脑)，称重。
按0.10 g脑(湿重)加入1.0 ml 2.0％高氯酸比例加入高氯酸，放入2.0ml的玻璃匀浆管内，冰浴下匀浆。
将匀浆液收集于1.5ml离心管中，于1.4×104 r／min下低温离心20 min，取上清液0.22μm的滤器过滤进样检测。
以保留时间定性，外标法定量。