电转印到膜上
图像分析
Western blot检测
选择目标蛋白斑点，胶内酶切
质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）
获得肽质量指纹谱或肽序列标签
数据库检索鉴定蛋白质
Western blot、 免疫组化验证 蛋白质并确定 其定位
根据氨基酸序 列合成寡核苷 酸探针，克隆 基因
蛋白质功能研究，包 括蛋白质生物活性、 抗体制备、蛋白质相 互作用等方面
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3.2.3 蛋白质组研究技术
一、双向凝胶电泳技术 二、液相色谱技术 三、生物质谱技术与蛋白质鉴定 四、蛋白质相互作用的研究技术
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一、双向凝胶电泳技术 （一）2-DE的概念 two dimensional gel electrophoresis
• 2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDSPAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝 胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质 等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是 根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。
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（三）双向凝胶电泳图谱的计算机分析 • 细胞或组织样本经2-DE分离后，得到一张含有成
百上千个蛋白质斑点的凝胶电泳图谱。凝胶图谱 分析包括确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深 浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑 点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、 数据库分析等内容。借助先进的计算机技术和生 物信息学工具，能客观、有效地从电泳图谱中提 取到有价值的信息。
记等
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（一）考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色 方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲 烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋 白质的碱性基团可逆结合，染色线性范围 可达1～55μg，灵敏度为30～100ng蛋白质 。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复 性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定 ，灵敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于 银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋 白质的检测要求，样品用量大。
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3.1概述
蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是 Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋 白质）
1994年由澳大利亚科学家Wilkins提出，是一个动态的概念， 指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质
蛋白质组（原核生物和真核生物）
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第一向等电聚焦
酸
pH梯度
碱
低 分 子 量 第 二 向
IPG胶条
SDS-PAGE
高 分 子 量
图7-2 双向凝胶电泳示意图
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1、第一向电泳―IPG等电聚焦电泳
1）等电聚焦电泳的基本原理 等电聚焦（IEF）是60年代发 展起来的一种蛋白质分析分离手段，如图所示，在电场中 电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由 于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移 动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运 动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而 留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集在各自的pI处 ，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点 聚焦。
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（五）双向凝胶电泳分离前的样品处理 1、分部提取法 用不同的蛋白质提取液分 部抽提细胞或组织裂解液，先用水溶液抽 提，离心后的上清液中含大部分水溶性蛋 白；再用对膜蛋白具有中等溶解度的提取 液抽提沉淀，离心后上清液中含中等疏水 性的蛋白质，包括膜表面蛋白和膜相关蛋 白；最后用强溶解力的提取液抽提沉淀， 得到疏水性强的蛋白质。
荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。用于 蛋白质染色的荧光染料很多，有的共价结 合于蛋白质上，有的和蛋白质形成非共价 结 合 。 目 前 商 品 化 的 荧 光 染 料有 SYPRO Ruby, 其染色方法操作简便，灵敏度高达1 ～10ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂 蛋白染色效果好，不影响后续的质谱鉴定 ，是一种较理想的蛋白质染色方法，但价 格较昂贵。
对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个 或几个蛋白质
同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 在空间和时间上动态变化着的整体
整体性、动态性和系统性
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3.1.3 蛋白质组学
蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白 质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动 态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白 质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动 规律。
3、激光捕获显微切割技术（LCM） • 1996年基因公司发明了一种称为激光捕获
显微切割（LCM）的新技术，即在显微镜 下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞 群或单个细胞的技术。它成功地解决了组 织中的细胞异质性问题,是分子病理学和肿 瘤基因组学研究的一项革命性技术
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二、生物质谱技术与蛋白质鉴定 （一）质谱的基本原理
charge
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双向电泳的流程
样品制备 第一向等电聚焦 第二向SDS-PAGE 凝胶上蛋白的检测 蛋白的软件的检测
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（二）凝胶上蛋白质的检测 ➢蛋白质样品经2-DE分离后，凝胶上的蛋白
质斑点须用一定的方法使其显现出来，让 仪器或人眼检测到。
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染色方法
• 考马斯亮蓝染色 • 银染（不含戊二醛） • 荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标
蛋白质组学包括: 细胞器蛋白质组学：通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白质
复合物组成来确定蛋白质在亚细胞结构中的位置。 表达蛋白组学：把细胞、组织中的所有蛋白质建立成定量表
达图谱或扫描EST图。
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样品处理
蛋 白 蛋白质分离 质 组 学 研 究 蛋白质鉴定 流 程 图
蛋白质样品
电泳前蛋白质样品的处理
双向电泳分离
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10 0
相 80
对
强
度 （
60
％
）
40
20
0
基峰 分子离子峰
20
40
60
80
质荷比（m/z)
图7-6 质谱棒图
10 0
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（二）生物质谱
完整的现代质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、离子检测 器、数据处理及控制系统五部分组成，此外还有一个保持质谱仪高真 空度的真空系统。离子源和质量分析器是质谱仪最重要的两个部件， 也是不同质谱仪的主要差别所在。电喷雾质谱（ESI）和基质辅助激 光解吸电离飞行时间质谱（MALDI）为离子源的质谱技术已广泛应用 于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具，因此
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（二）银染色 原理 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离 子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离 子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而 呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马 斯亮蓝染色法的100倍，但操作繁琐，重复 性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结 合蛋白的染色效果差。
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(三) 荧光染料染色 荧光染料染色法是利用结合于蛋白质的
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蛋白质组学的研究内容
1、蛋白质组表达模式（组成）的研究 ➢ 蛋白质组成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质
的发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工和修饰 分析。 2、蛋白质组功能模式（作用）的研究 ➢ 基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制 分析。 ➢ 重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化 与发育、环境反应与调节等）。 ➢ 医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、 肿瘤分子标记、人体病理介导分子等）。
• 质谱分析法（MS）是指在一定条件下，将样品分 子电离成离子，然后通过测定这些离子的质荷比 （m/z）和强度来进行定性和定量的一种分析方法 。质谱分析法的过程为：将样品气化并电离成带 电离子，然后通过一定方法将不同m/z的离子分开 ，并测定其强度，绘出质谱图，对质谱图进行分 析可得到关于样品分子结构和定量方面的信息。
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F= Bzv
1 m v2
2
mv2 F’＝ Rm
B
Rm
离子检测器
U
离子源 S
质谱方程 ： m
zHale Waihona Puke ＝B 2 Rm 2 2U
图7-5 质谱仪的原理
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• 有机分子受到电子轰击后，会断裂形成不 同的多种离子，以离子的质荷比m/z为横座 标，离子强度为纵坐标作图，得到的质谱 图称为标准质谱图，也叫棒图。
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• 蛋白质组学研究需要有高通量的蛋白质鉴 定方法，MS技术能快速、准确地获得多种 蛋白质属性参数，结合生物信息学工具， 可迅速进行蛋白质的鉴定。因此，MS已成 为蛋白质组学研究中不可或缺的有力工具 。下面介绍两种应用MS技术进行蛋白质鉴 定的方法。
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1、肽质量指纹图谱法
基本过程为：蛋白质混合物样品经过2-DE分离后 ，从胶上切下需要鉴定的蛋白质斑点，用胰蛋白 酶进行水解，胰蛋白酶在特定位点切割蛋白质， 形成长短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF质谱 仪对多肽混合物进行质量分析，得到肽片段质谱 图，一个质谱峰代表一种肽片段离子。由于各种 蛋白质的一级结构不同，胰酶水解后产生的肽片 段数目及质量均不相同，具有特征性，因此将得 到 的 肽 片 段 质 谱 图 称 为 PMF 。 下 图 为 卵 白 蛋 白 PMF：
11
－
pH
10
9
pI＝8.0蛋白质
8
7
6
5
pI＝4.0蛋白质
4
3
2
＋
等电聚焦的“聚焦效应”
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第一向：等电聚焦
+
pH 3
pH 7.5
+
pH 3
pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
+