2、新型非凝胶技术
◆高效液相色谱法 High performance liquid chromatography，HPLC ◆毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE ◆液相等点聚焦和毛细管色谱
capillary electrochromatography
★ 特点： 自动化程度高、分辨率高，检测限低。
蛋白质组学研究的内容
•蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究
蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与 基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行 表征,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。 双向凝胶电泳(2-DＥ)和质谱(Mass spectrometry)技 术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术
优点
固相pH梯度等电聚焦的优点
◆克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 ◆稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二 轮分析，大大提高了分辨率及重复性。
第二向SDS-PAGE电泳
垂直板电泳
水平超薄胶电泳
双向电泳典型过程包括：

①蛋白质样品制备：要防止蛋白质酶降解蛋白质。 ②上样
鉴定和注释蛋白质的路线

通过肽质量谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹 配

通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或 氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配
仪 器

MALDI-TOF－MS质谱仪：灵敏度高（可达
fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以
及受缓冲液、盐份的干扰小 .
பைடு நூலகம்

• 在蛋白质组学研究中，为了提高质谱的适用范围 和工作性能，常将不同类型的质量分析器串联起 来使用。因此，目前最为常用的质谱分析系统包 括两大类： • 以单一质谱为基础的
– – – – 电喷雾－三级四级杆质谱 电喷雾－离子阱质谱 电喷雾－傅里叶变换离子回旋共振质谱 基质辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱


一种是IPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上 样。 别一种是将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时 样品出参入了胶条。

③IPG的运行和平衡 ④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑤胶上蛋白质检测和定量：

荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远高 地银染，与质谱兼容性好。
第11章
蛋白质组学及其在微生物学 研究中的应用
主要内容
第一节 引言 第二节 蛋白质组学研究基本技术 第三节 微生物蛋白质组学
第一节
背景

引言
基因组时代 →后基因组时代 核苷酸序列本身很难直接与生命功能和生命 现象挂起钩，而蛋白质才是生物功能的最终 执行者。

蛋白质数目大大超过基因数目。 蛋白质随时


可分离10～100 kD分子量的蛋白 质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配
第一向IEF电泳

传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。

pH凝胶制作的不稳定和重复性差限制了 等点聚焦电泳技术的应用，

Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯 度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将之 应用于双向电泳。



固相化PH梯度二维电泳（IPG-2-DE)的 发明与完善； 生物质谱，即应用软电离技术对生物大分 子进行分析的质谱技术的发展； 生物信息学发展。
一、蛋白质组研究中的蛋白质分离
（一）、二维（双向）凝胶电泳twodimensional electrophoresis，2-DE)：
◆ 利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶
联合技术精确鉴定蛋白质
组织切片或印片原位质谱分析技术
两级飞行时间串联质谱（MALDITOF/TOF）
傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）
表面增强激光解吸/电离飞行时间质
谱（SELDI-TOF-MS）
（三）、定量蛋白质组学研究
概念：把一个基因组表达的全部
蛋白质或一个复杂体系中所有的
蛋白质进行精确的定量和鉴定。

用于蛋白质检测的荧光染料有两大类：


一类能与蛋白质共价结合的荧光染料，如花菁 染料Cy3,Cy5. 另一类是非共价结合荧光染料，包括苯乙烯基 染料 Sypro系列、尼罗河红等。
二维电泳前进标记 电泳后标记

荧光染色常用的方式有两种：

2、基于稳定同位素技术的质谱定量法
◎同位素标记法基本原理：将待比较的一对肽段样 品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记 和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可 以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对， 通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标 记和未标记肽段的相对丰度。

缺点：只能鉴定数据库中已经存在的蛋白质， 而且有一部分蛋白质在只有PMF信息时不能 得到可靠的鉴定，因此需要进一步分析肽段的 序列信息来鉴定蛋白质




串联质谱的肽序列标签（PST） 应用串联质谱中得到的部分氨基酸序列结 合此序列前后的离子质量和肽段母离子质 量，在数据库中检索以鉴定蛋白质，称为 肽序列标签技术。 相比单独的肽质量指纹谱技术，PST搜索 数据库得到的结果更可信。 一般串联质谱仪电喷雾－串联质谱（ESIMS/MS)可用于肽段序列的测定。
采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究 的基本路线



在非凝胶分离技术中，高效液相色谱由于其分离 原理多样，易于组合多维分离模式和与质谱直接 联用而获得了广泛的研究和应用。 高效液相色谱的原理：溶于流动相中各组分经过 固定相时，与固定相发生相互作用，由于相互作 用大小、强弱的不同，各组分在固定相中滞留的 时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同， 最终使不同组成成分得到分离。 经典的高效液相色谱系统由输液系统、进样系统、 分离系统和检测系统构成。质谱起到了检测器的 作用。

⑥图像采集、分析及数据处理
2-DE技术的缺点
◆ 所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分
离范围一般为8~200kD，对极碱性蛋白质，疏水性蛋 白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于
有效分离。
◆ 在2－D胶上有些蛋白质点量太少，难以进 行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低 难于与质谱联用实现自动化性质联用。

液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以
代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽 段分子量，再通过串联MS技术，得到部分 序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定 蛋白质。

多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） 根据蛋白质带电性及疏水性不同， 用MS分离多肽复合物。
★ 蛋白质组发展的瓶颈是缺乏自动化的蛋白 质分析的完整途径。
第二节 蛋白质组学研究基本技术

典型的蛋白质组学研究常分为四个步骤：
从生物学物质（如细胞、组织、体液等） 提取蛋白质混合液
分离蛋白质混合液
将有意义的蛋白质消化 成肽进行质谱分析 将质谱获得的数据利用各种 生物信息学工具进行分析


蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴 定和解析蛋白质技术的进步。 重要技术突破主要包括三点：

电喷雾离子化：是利用喷口的高电场使质谱 仪进样端毛细管柱流出的含有样品的液体成 为带电荷的微滴。随着挥发性溶剂的蒸发， 微滴半径减少而表面电荷密度增加，直至达 到一定临界值，液滴爆裂为带电荷的子微滴。 这一过程不断重复使最终的微滴非常细小呈 雾状。这时液滴表面的电场很强，使蛋白质 等被分析分子离子化并以带一个或多个电荷 的离子的形式进入气相。
间和空间而变化。

mRNA水平的基因表达研究取得进 展，但mRNA与蛋白质间的相关系 数仅为0.4～0.5

蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA
水平得到解答
蛋白质组学的概念
蛋白质组是澳大利亚学者Williams 和Wilkins于1994年首先提出， 被定义为：一个基因组/一种生物或 一种细胞/组织所表达的全部蛋白质。
化学特性，分离各种蛋白质的方法。
原理
◆第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚
焦电泳技术(IEF)将蛋白质混合物按照等电
点高低进行分离, 再在第一向垂直方向上进
行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
PAGE)按照相对分子质量大小进行蛋白质
分离。
◆1975年首先由O’Farrell等创立。
特 点
• 以串联质谱为基础的
– 电喷雾－三级四级杆－飞行时间质谱 – 基质辅助激光解吸离子化－三级四级杆－飞行时间质谱 – 基质辅助激光解吸离子化－串联飞行时间质谱
（二）、应用生物质谱鉴定蛋白质
• 肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）是蛋白质的一种重要属性，也是目前蛋白质组 学研究中鉴定蛋白质的常春藤用研究方法之一。 1993年由多研究小组分别独立提出。 • 肽质量指纹谱指的是蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶 切割后得到的一套特征性有肽片断质量图谱。由于每 种蛋白质的氨基酸序列都不相同，蛋白质被特异性的 蛋白酶消化后所产生的肽片断序列及其质量的构成也 具有特异性，可用于与数据库中所有蛋白质酶解的理 论肽质量谱匹配来鉴定蛋白质。 • 目前测定肽混合物质量质量谱最有效的质谱仪是基质 辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱（MALDI-TOFMS)，适合测定的相对分子质量范围在五百到数千道 尔顿，并需要用已知相对分子质量的蛋白质作内标。
蛋白质定量的难点
低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在50%以 下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化
目前常用的蛋白质组定量方法包括：

1、基于荧光染色技术的电泳定量法 2、基于稳定同位素技术的质谱定量法